呼奶英，于佳田，別會(huì)杰，王德廣(徐州醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004)

癲癇(epilepsy)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以腦內(nèi)神經(jīng)元突發(fā)性異常放電為著。其持續(xù)存在的自發(fā)反復(fù)發(fā)作對(duì)患者身體、生活、心理、認(rèn)知等造成嚴(yán)重影響，并可伴隨終身[1]。因此，其病因及發(fā)病機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)，但尚未完全闡明[1-3]。目前，普遍接受的學(xué)說是神經(jīng)元及神經(jīng)環(huán)路興奮性-抑制性系統(tǒng)的失衡。另與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)及受體改變、血腦屏障破壞、離子通道異常、突觸重塑、膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)發(fā)生、基因突變、免疫、遺傳等有關(guān)[3]。也有研究表明，癲癇發(fā)生發(fā)展中存在包括DNA甲基化、組蛋白去乙酰化等異常的表觀遺傳學(xué)修飾，廣泛影響癲癇相關(guān)基因的表達(dá)[4 - 5]，這可能是重要的發(fā)病因素之一。

神經(jīng)元限制性沉默因子(repressor element silencing transcription factor，REST)是一種Cys2/His2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元的發(fā)育及疾病中具有重要的作用，與DNA中的神經(jīng)元限制性沉默元件RE-1結(jié)合，修飾DNA、組蛋白及染色質(zhì)等，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響神經(jīng)元離子通道的表達(dá)、突觸形成及傳遞和神經(jīng)元的發(fā)生，從而影響神經(jīng)元興奮性等[5-6]。癲癇動(dòng)物模型的研究表明，海馬區(qū)REST表達(dá)上調(diào)，可調(diào)控生長(zhǎng)因子、離子通道蛋白、細(xì)胞間縫隙連接、神經(jīng)遞質(zhì)受體等的表達(dá)。海人酸誘導(dǎo)癲癇大鼠中，REST表達(dá)上調(diào)可抑制Calb1、Glra2、Grin2a、Hcn1、Kcnc2、Klf9和Myo5b等基因的表達(dá)，影響改變離子通道性質(zhì)，紊亂神經(jīng)元或神經(jīng)環(huán)路興奮性-抑制性平衡系統(tǒng)，參與癲癇的發(fā)生[7]。McClelland等人[8]進(jìn)一步研究已明確，超級(jí)化激活環(huán)核苷酸陽離子通道(HCN1)的表達(dá)于癲癇發(fā)生后受到REST的顯著抑制，以致對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性的抑制作用降低，加速癲癇的形成。杏仁核快速電點(diǎn)燃癲癇模型是目前難治性癲癇研究中公認(rèn)的理想模型之一[9]，其中REST的表達(dá)變化情況及其相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探究癲癇發(fā)生后不同時(shí)間內(nèi)REST表達(dá)變化，揭示其變化規(guī)律及其可能的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠24只，體重250～300 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK (蘇) 2015-0009]。所有大鼠在徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK (蘇) 2016-0028]，屏障環(huán)境，室溫22～25℃，濕度50%～70%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，每日提供充足標(biāo)準(zhǔn)食物與飲水。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗REST多克隆抗體購(gòu)自艾博抗上海貿(mào)易有限公司，鼠抗NeuN單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；生物素化羊抗鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。腦立體定位儀(美國(guó)Stoelting公司)；YLS-9A生理、藥理電子刺激儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；研究級(jí)系統(tǒng)顯微鏡BX-41(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、癲癇模型2 h組(EP-2 h組)、癲癇模型14 d組(EP-14 d組)和癲癇模型35 d組(EP-35 d組)。

1.3.2 癲癇模型制作

采用杏仁核快速電點(diǎn)燃癲癇模型，參考本實(shí)驗(yàn)室前期制作方法[10 - 11]。大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后固定于腦立體定位儀上，沿頭部正中矢狀位切開皮膚1.5～2 cm，充分暴露顱骨及前囟、冠狀縫、矢狀縫，參照Paxinos和Watson[12]的大鼠腦立體定位圖譜確定杏仁基外側(cè)核(basolateral amygdaloid nucleus，BLA)坐標(biāo)(AP=-2.0 mm，ML=-5.0 mm，DV=-8.3 mm)，顱鉆鉆孔，按照上述坐標(biāo)頭部植入雙螺旋電極。術(shù)后恢復(fù)1周，采用恒流電刺激右側(cè)杏仁基外側(cè)核，隔日刺激，刺激參數(shù)為恒流電雙相方波、波寬l ms、頻率為60 Hz、持續(xù)時(shí)間2 s，每日刺激均從10 μA電流強(qiáng)度開始，逐漸增加電流至70 μA或誘發(fā)出V級(jí)癲癇，大鼠行為學(xué)變化參考Racine法[13]分級(jí)。其中V級(jí)發(fā)作為繼發(fā)性全身性癲癇發(fā)作，如果動(dòng)物連續(xù)三次出現(xiàn)V級(jí)發(fā)作，即被完全點(diǎn)燃(kindled)。假手術(shù)組大鼠按照上述方法只植入電極，不予刺激。本研究過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷，充分考慮動(dòng)物福利原則，尊重善待動(dòng)物，最大程度減少對(duì)動(dòng)物的傷害和動(dòng)物的痛苦。

1.3.3 灌注、取腦及冰凍切片

末次刺激后2 h、14 d、35 d，大鼠麻醉灌注、取腦后固定，30%蔗糖沉底后行連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm。

1.3.4 NeuN/REST免疫組織化學(xué)染色

取各組大鼠腦片入3% H2O2清除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育30 min，10%羊血清室溫封閉2 h，入鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶100)或兔抗鼠REST多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育48 h，生物素化羊抗鼠/兔IgG(1∶200)室溫孵育4 h，鏈霉卵白素-HRP(1∶200)室溫孵育2 h，DAB/H2O2顯色觀察。貼片、酒精脫水，二甲苯透明和封片。

1.3.5 圖像數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)NeuN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

結(jié)果顯示杏仁核快速電點(diǎn)燃癲癇完全點(diǎn)燃后2 h時(shí)，海馬CA1、CA3和DG區(qū)域NeuN陽性神經(jīng)元未發(fā)生明顯變化；14 d、35 d時(shí)，該區(qū)域NeuN陽性神經(jīng)元丟失明顯，細(xì)胞間距增大、排列松散、染色淺淡。見圖1。量化分析顯示，與假手術(shù)組比較，EP-2 h組差異無顯著性(P> 0.05)，EP-14 d和EP-35 d組NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)丟失明顯(P< 0.05)。見圖2。

注：A～D：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇2 h組、杏仁核電點(diǎn)燃14 d組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇35 d組CA1部位NeuN表達(dá)；A1～D1：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇2 h組、杏仁核電點(diǎn)燃14 d組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇35 d組CA3部位NeuN表達(dá)；A2～D2：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇2 h組、杏仁核電點(diǎn)燃14 d組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇35 d組DG部位NeuN表達(dá)。圖1 杏仁核電刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬區(qū)NeuN表達(dá)減少Note.A-D: Expression of NeuN in the hippocampal CA1 region of rats in the sham group, electrical amygdala kindling epilepsy 2 h group, electrical amygdala kindling epilepsy 14 d group, electrical amygdala kindling epilepsy 35 d group. A1-D1: Expression of NeuN in the hippocampal CA3 region of rats in those four groups. A2-D2: Expression of NeuN in the hippocampal DG region of rats in those four groups.Fig.1 NeuN immunohistochemistry was decreased in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

注：EP-2 h組、EP-14 d組和EP-35 d組海馬CA1、CA3、DG部位NeuN陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組相同部位比較，*P< 0.05。圖2 杏仁核電刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬NeuN陽性細(xì)胞數(shù)減少Note.The number of NeuN positive neurons in the hippocampal CA1, CA3 and DG regions of rats in the group EP-2 h, group EP-14 d and group EP-35 d was compared with that in the same regions of rats in the sham group,*P< 0.05.Fig.2 The number of NeuN positive neurons was decreased in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

注：A～D：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇2 h組、杏仁核電點(diǎn)燃14 d組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇35 d組CA1部位REST表達(dá)；A1～D1：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇2 h組、杏仁核電點(diǎn)燃14 d組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇35 d組CA3部位REST表達(dá)；A2～D2：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇2 h組、杏仁核電點(diǎn)燃14 d組、杏仁核電點(diǎn)燃癲癇35 d組DG部位REST表達(dá)。圖3 杏仁核刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬CA1、CA3和DG部位REST表達(dá)上調(diào)Note.A-D: Expression of REST in the hippocampal CA1 region of rats in the sham group, electrical amygdala kindling epilepsy 2 h group, electrical amygdala kindling epilepsy 14 d group, electrical amygdala kindling epilepsy 35 d group. A1-D1: Expression of REST in the hippocampal CA3 region of rats in those four groups. A2-D2: Expression of REST in the hippocampal DG region of rats in those four groups.Fig.3 REST immunohistochemistry was increased in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

2.2 各組大鼠海馬各區(qū)REST免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

結(jié)果顯示海馬CA1、CA3和DG區(qū)錐體細(xì)胞層REST表達(dá)明顯，REST陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，棕褐色。杏仁核快速電點(diǎn)燃癲癇完全點(diǎn)燃后2 h時(shí)，海馬CA1、CA3和DG區(qū)錐體細(xì)胞層REST陽性表達(dá)明顯增加；14 d、35 d時(shí)，該區(qū)域REST陽性表達(dá)較假手術(shù)組稍有增加。見圖3。量化分析顯示，與假手術(shù)組比較，EP-2 h組、EP-14 d和EP-35 d組REST陽性表達(dá)明顯上調(diào)(P< 0.05)。見圖4。

注：EP-2 h組、EP-14 d組和EP-35 d組海馬CA1、CA3和DG部位REST積分光密度值與假手術(shù)組相同部位比較，*P< 0.05。圖4 杏仁核刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬REST表達(dá)上調(diào)Note.The intergraloptical density of REST in the hippocampal CA1, CA3 and DG regions of rats in the group EP-2 h, group EP-14 d and group EP-35 d was compared with that in the same regions of rats in the sham group,*P< 0.05.Fig.4 REST expression was higher in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

3 討論

顳葉癲癇作為癲癇疾病最為常見的類型，以大腦內(nèi)神經(jīng)元突發(fā)性異常放電為著，神經(jīng)元興奮性升高及突觸重塑是重要的病理生理改變。但其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚[14]。近來相關(guān)研究表明，REST可限制性沉默神經(jīng)元特異性基因，這不僅在神經(jīng)發(fā)生發(fā)育中具有重要作用，在成熟神經(jīng)元、亨廷頓、癲癇等疾病中亦具有重要作用[15]。癲癇發(fā)生后，REST通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，改變神經(jīng)元離子通道及受體的數(shù)量活性或分布、海馬苔蘚纖維出芽、突觸重塑等，影響神經(jīng)元膜電位分布、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及神經(jīng)傳導(dǎo)等，造成神經(jīng)元過度興奮[5]，這在癲癇疾病中可能起著重要作用。

本研究采用杏仁核快速電點(diǎn)燃方式建立成年大鼠癲癇模型，檢測(cè)到海馬區(qū)NeuN的表達(dá)于癲癇發(fā)生后14 d、35 d出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元丟失，這與目前研究認(rèn)為的癲癇發(fā)生后海馬硬化的特征性改變一致[16]。顳葉癲癇發(fā)生可引起海馬部位明顯的神經(jīng)元死亡的同時(shí)也會(huì)引起神經(jīng)發(fā)生[17-19]，這可能與REST表達(dá)變化相關(guān)。本研究中檢測(cè)到杏仁核快速電點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬組織錐體細(xì)胞及DG顆粒細(xì)胞中REST表達(dá)持續(xù)上調(diào)，2 h達(dá)峰。REST持續(xù)上調(diào)，選擇性識(shí)別結(jié)合癲癇相關(guān)基因中的RE-1元件，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)相關(guān)靶基因表達(dá)進(jìn)行沉默或抑制，改變神經(jīng)元離子通道數(shù)量或特性、突觸結(jié)構(gòu)等，致使神經(jīng)元興奮性升高或(和)局部興奮性突觸環(huán)路形成，癲癇易感性增加。海馬組織是腦內(nèi)與癲癇發(fā)生密切相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)之一，其中有近600多種編碼離子通道、受體及其它影響神經(jīng)元功能的基因[20]均含有RE-1元件，且成年大鼠海馬區(qū)是腦內(nèi)REST含量最高的區(qū)域之一，因此，該區(qū)域REST相關(guān)作用十分重要且復(fù)雜。McClelland等人[7 - 8]的研究表明，癲癇發(fā)生后海馬組織內(nèi)REST表達(dá)上調(diào)，其中Ca2+相關(guān)基因Calb1、Myo5b和Grin2a，K+相關(guān)基因Kcnc2和Klf9，以及Cl-相關(guān)基因Glra2等基因中的RE-1元件與REST結(jié)合增強(qiáng)，染色質(zhì)發(fā)生持續(xù)性改變，相應(yīng)的基因產(chǎn)物表達(dá)持續(xù)下調(diào)，神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度增加和(或)Cl-內(nèi)流減少等變化，導(dǎo)致神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+超載或Cl-穩(wěn)態(tài)失衡，綜合引起神經(jīng)元興奮性增高，致使癲癇反復(fù)發(fā)作或發(fā)作的易感性增高。研究也表明，對(duì)于維持神經(jīng)元興奮性十分重要的離子型谷氨酸受體GLUA2、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF等的表達(dá)，也受REST的調(diào)控[5]。選擇性敲除小鼠前腦REST基因，海馬區(qū)相關(guān)靶基因產(chǎn)物成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF14及腦源性生長(zhǎng)因子BDNF表達(dá)上調(diào)，DG顆粒細(xì)胞軸突出芽增加，形成異常局部興奮性突觸環(huán)路，癲癇易感性增加[21]。因此REST也有可能是抑制癲癇發(fā)作內(nèi)源性因子。

總之，REST作為一種作用廣泛的神經(jīng)元限制性沉默因子，與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)，受其抑制的基因以及潛在可被抑制的基因眾多[22 - 23]。杏仁核快速電刺激癲癇大鼠海馬REST的持續(xù)顯著上調(diào)，可能引起相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)及受體、離子通道蛋白等相關(guān)基因產(chǎn)物的表達(dá)變化，進(jìn)而影響神經(jīng)元興奮性或神經(jīng)環(huán)路興奮性傳導(dǎo)，參與癲癇的發(fā)生[15,20,24]。對(duì)于杏仁核快速電點(diǎn)燃癲癇大鼠中REST的相關(guān)作用，將進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。

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