張 默，吳 迪，何小奪，齊志剛，李坤成*，陳 健(.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院影像科，北京 0005； .首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中美神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 0005； .首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 0005)

腦血管病是危害人類生命健康的最常見疾病之一，其中缺血性腦血管病(ischemia cerebrovascular disease，ICVD)約占全部腦血管病的80%，具有死亡率和致殘率高的特點(diǎn)[1]。采用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)進(jìn)行溶栓治療是唯一被證實(shí)治療卒中的有效方法[2-3]。但是，在非人靈長類動物(nonhuman primates，NHPs)上模擬急性腦梗死發(fā)病、治療的模型鮮有報道。恒河猴與人類親緣關(guān)系密切，在器官代謝功能、體格特點(diǎn)及基因遺傳水平等許多生物學(xué)特性方面與人類較為接近，因此成為近年來各種藥物、疾病的病理生理機(jī)制研究的重要模型[4]。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術(shù)作為一種無創(chuàng)檢查技術(shù)，已成為腦梗死的重要檢查手段，甚至是首選檢查方案。其中常規(guī)掃描T2加權(quán)圖像(T2WI)可用于觀察病變；T2磁共振成像液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列(T2-FLAIR)可在T2WI中抑制腦脊液的高信號，使鄰近腦脊液、具有高信號(長T2)的病變得以顯示清楚；使用時間飛躍法血管成像技術(shù)(TOF-MRA)可無創(chuàng)得到大腦內(nèi)血管圖像；彌散加權(quán)成像(diffusion-weighted imaging，DWI)等已經(jīng)被較多地應(yīng)用于腦梗死的研究之中[5]。本研究建立了大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，并對其進(jìn)行溶栓治療，通過磁共振技術(shù)觀察梗死區(qū)域組織及血流變化，比較不同治療時長的療效，以期指導(dǎo)臨床治療。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

成年雄性恒河猴8只，清潔級，平均年齡(8.2±1.2)歲，平均體重(9.4±1.0) kg，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心提供[SCXK (軍) 2012-0019]。動物日常喂養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物室[SYXK (京) 2014-0018]，每只動物均單獨(dú)飼養(yǎng)，購買后喂養(yǎng)一個月以上方用于實(shí)驗。所用實(shí)驗動物經(jīng)檢測排除結(jié)核、志賀氏菌、沙門氏菌、寄生蟲、B病毒感染等疾病。其中4只動物接受血栓注射(梗死組)，其余4只動物接受溶栓治療(溶栓組)。實(shí)驗方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(AEEI-2016-174)。

1.2 主要試劑與儀器

所用麻醉藥品：丙泊酚(10 mL/100 mg，批號：320040，AstraZeneca UK Limited)；氯胺酮(2 mL/0.1 g，批號：111207，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國)；速眠新(批號：201403，廣州萊綠寵商貿(mào)有限公司，中國)。

實(shí)驗所用磁共振設(shè)備為Simens公司生產(chǎn)的Verio 3T超導(dǎo)磁共振掃描儀，搭配使用Simens 32通道頭部線圈；使用Simens Syngo后處理工作平臺對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。其他器材包括微導(dǎo)絲(Traxcess 14，Microvention，美國)；Rebar 18微導(dǎo)管(Micro Therapeutics，美國)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 恒河猴大腦中動脈栓塞模型的建立[6]

模型動物術(shù)前8 h禁水，2 h禁食，對實(shí)驗動物的生命體征全程監(jiān)測，手術(shù)臺通過電熱毯輔助加熱，動物肛溫控制在37℃，肌內(nèi)注射氯胺酮(2 mL)+速眠新(1 mL)誘導(dǎo)麻醉，丙泊酚0.3～0.4 mg/(kg·h)持續(xù)靜脈滴注麻醉。手術(shù)過程中，對體溫、心率、有創(chuàng)動脈壓、呼吸、血氧飽和度進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測，間斷進(jìn)行血?dú)夥治?。固定恒河猴于仰臥位，頭部正位。采用冠狀動脈造影用5 F動脈鞘組穿刺針、導(dǎo)引鋼絲、動脈鞘行經(jīng)皮穿刺股動脈。在0.889 mm(0.035英寸)超滑導(dǎo)絲引導(dǎo)下，將5 F導(dǎo)引導(dǎo)管置入右側(cè)頸內(nèi)動脈。退出導(dǎo)絲后，行右側(cè)頸內(nèi)動脈正側(cè)位造影。使用微導(dǎo)，并將微導(dǎo)管頭端置入至右側(cè)M1段。退出微導(dǎo)絲，手推造影劑碘海醇2 mL，造影證實(shí)微導(dǎo)管頭端位于大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)近段。通過注射器將一根10 cm自體血栓打入微導(dǎo)管。局部腦缺血后2.5 h開始給予rt-PA溶栓治療。直視下縫合右側(cè)股動脈穿刺處，縫合皮下組織及皮膚，加壓包扎后將動物送回動物房。視動物術(shù)后狀態(tài)，靜脈滴注甘露醇等對癥治療，并給予保溫、營養(yǎng)等生命支持。

1.3.2 磁共振掃描方法

實(shí)驗前，對實(shí)驗對象進(jìn)行磁共振掃描，排除病變之后，對8只恒河猴分別進(jìn)行M1段梗死模型的制備。實(shí)驗分為兩組，梗死組不進(jìn)行溶栓，溶栓組進(jìn)行rt-PA溶栓治療。分別于術(shù)后4 h及24 h進(jìn)行磁共振掃描，掃描序列包括T2WI(TR=4000 ms，TE=100 ms，F(xiàn)OV=180 mm)，T2-FLAIR(TR=9000 ms，TE=96 ms，F(xiàn)OV=220 mm)，TOF-MRA(TR=20 ms，TE=3.6 ms，F(xiàn)OV=220 mm)，DWI(TR=6000 ms，TE=100 ms，F(xiàn)OV=220 mm)。分別在局部腦缺血后4 h和24 h進(jìn)行MRI掃描。使用后，處理工作站計算4 h和24 h的梗死體積(包括T2WI，T2-FLAIR和DWI)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大腦中動脈栓塞恒河猴表現(xiàn)

術(shù)后模型動物均恢復(fù)自主呼吸，出現(xiàn)對側(cè)神經(jīng)功能受損，表現(xiàn)為對側(cè)上肢和下肢無力，僅能用正常側(cè)上肢進(jìn)行抓取動作；對側(cè)上肢和下肢感覺功能障礙，對痛覺刺激無反應(yīng)；模型動物在進(jìn)食過程中均出現(xiàn)流涎癥狀。

2.2 評估大腦中動脈灌注情況

MRA顯示，注射血栓后4 h梗死組大腦中動脈主干閉塞，24 h梗死組大腦中動脈主干仍未再通(圖1)。經(jīng)溶栓治療后，注射血栓后4 h溶栓組的大腦中動脈主干實(shí)現(xiàn)再通，24 h溶栓模型大腦中動脈主干仍為再通狀態(tài)。

2.3 梗死體積評估

T2WI序列顯示，梗死組4 h、24 h的梗死體積分別為(2665±1519) mm3和(14 693±5078) mm3，溶栓組4 h、24 h的梗死體積分別為(2738±958) mm3和(7648±3101) mm3；梗死組梗死體積增量為(12 027±5507) mm3，溶栓組梗死體積增量為(4910±2764) mm3；兩組4 h梗死體積比較，差異無顯著性；溶栓組24 h梗死體積及4～24 h增量低于梗死組，差異有顯著性。見圖1、圖2、圖3。

DWI序列顯示，梗死組4 h、24 h的梗死體積分別為(8017±3593) mm3和(17 515±6024) mm3，溶栓組4 h、24 h的梗死體積分別為(5988±3032) mm3和(10 842±3529) mm3；梗死組梗死體積增量為(9498±5226) mm3，溶栓組梗死體積增量為(4854±1792) mm3；兩組4 h梗死體積比較，差異無顯著性；溶栓組24 h梗死體積及4～24 h增量低于梗死組，差異有顯著性。見圖1、圖2、圖4。

3 討論

腦缺血動物模型是研究腦血管疾病損傷機(jī)制和防治措施的基礎(chǔ)，尤其是近期許多大腦保護(hù)藥物臨床III期的失敗，更顯示出適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ蛯τ谀X梗死研究的重要性。嚙齒類動物的腦梗死模型過于簡單，與人類之間有著巨大的種屬差異[7]，不足以反映人類腦梗死的復(fù)雜性和動態(tài)變化。而非人靈長類動物在基因上非常接近于人類，其大腦的解剖結(jié)構(gòu)，特別是大腦中動脈的分布區(qū)域與人類相似，而且腦的大小也適合進(jìn)行MRI研究，因此美國卒中治療專業(yè)委員會建議，新的神經(jīng)保護(hù)藥物進(jìn)行臨床試驗之前，應(yīng)該以非人靈長類動物梗死模型作為動物模型進(jìn)行臨床前研究[8]。

注：從左至右依次為TOF-MRA，T2WI，DWI，T2-FLAIR。圖1 梗死組4 h、24 h磁共振影像Note.From left to right, figures show TOF-MRA, T2WI, DWI, and T2-FLAIR images, respectively.Fig.1 MRI of the infarction group at 4 h and 24 h

注：從左至右依次為TOF-MRA，T2WI，DWI，T2-FLAIR。圖2 溶栓組4 h、24 h磁共振影像Note.From left to right, figures show TOF-MRA, T2WI, DWI, and T2-FLAIR images, respectively.Fig.2 MRI of the thrombolysis group at 4 h and 24 h

圖3 T2WI序列顯示梗死組和溶栓組在4 h、24 h的梗死體積及梗死體積增量Fig.3 Volume with increases of cerebral infarction by T2WI in the infarction group and thrombolysis group at 4 h and 24 h

圖4 DWI序列顯示梗死組和溶栓組在4 h、24 h的梗死體積及梗死體積增量Fig.4 Volume with increases of cerebral infarction by DWI in the infarction group and thrombolysis group at 4 h and 24 h

大腦中動脈(MCA)是人類腦缺血的多發(fā)部位，絕大多數(shù)的腦缺血模型都是針對MCA展開的。非人靈長類動物局部腦缺血模型的建立方法可大致分為血管內(nèi)介入方法和開顱手術(shù)方法，Marshall等[9]研究指出，恒河猴血栓-溶栓模型與卒中患者發(fā)病治療過程一致。在各種模型制作方法中，血管內(nèi)介入方法的模型制備過程與腦卒中的發(fā)病過程非常相似，因此值得特別關(guān)注[10]。但是，由于技術(shù)等原因，采用血管內(nèi)介入方法制備急性腦缺血模型的報道非常少。本實(shí)驗采取的血栓模型，同時模擬了血栓發(fā)生過程和干預(yù)治療的過程，更適合用來評估干預(yù)效果[11]。

目前，3T場強(qiáng)的高場強(qiáng)磁共振掃描儀用于診斷急性腦血管病及其并發(fā)癥，已經(jīng)在臨床上得到了廣泛開展。非人靈長類動物體型與人類嬰幼兒相近，配合高通道數(shù)的32通道頭部線圈和GRAPPA并行采集技術(shù)的使用，可以在保持較高空間分辨率的情況下，同時大幅度縮短掃描時間，得到清晰準(zhǔn)確的圖像，也允許在較短的時間窗內(nèi)，獲得更多模態(tài)的MRI圖像[12]。通過TOF-MRA掃描，可以準(zhǔn)確觀察到，在梗死模型制備并進(jìn)行溶栓后，實(shí)驗側(cè)血管的再通情況以及與正常側(cè)血管形態(tài)的對比。在梗死模型制備后，實(shí)驗側(cè)的血流明顯減少，梗死組動物的實(shí)驗側(cè)血管于血栓位置截斷，4 h和24 h時遠(yuǎn)端血管都不能顯示。溶栓組進(jìn)行溶栓再通后，遠(yuǎn)端血管恢復(fù)血流，4 h和24 h均保持可見，明確了溶栓操作的效果。

磁共振彌散加權(quán)成像(DWI)可以無創(chuàng)地檢測活體組織內(nèi)的水分子自由擴(kuò)散運(yùn)動，在臨床上，主要應(yīng)用于診斷超早期腦缺血，腦組織急性缺血后，因為腦供血不足，導(dǎo)致微循環(huán)灌注障礙，致使細(xì)胞缺氧，ATP生成減少，鈉鉀泵衰竭，導(dǎo)致K+外流，Na+、Cl-、Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)滲透壓增高，大量水分子進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒性水腫，導(dǎo)致水分子自由擴(kuò)散運(yùn)動異常，DWI表現(xiàn)為病灶區(qū)域出現(xiàn)異常高信號。與常用FSE序列相比，可以更早地確定缺血病灶位置[13 - 14]。

通過工作站分別計算梗死組和溶栓組4 h、24 h不同時間點(diǎn)的T2WI以及DWI圖像中的梗死體積，可以發(fā)現(xiàn)梗死組與溶栓組于4 h時顯示的梗死面積并無較大差異，而24 h時，T2WI、DWI圖像顯示，兩組實(shí)驗動物的大腦血管狀態(tài)有明確的不同，梗死體積有顯著的差異。由此可以得出，通過多參數(shù)高場強(qiáng)磁共振成像，可以對梗死-溶栓模型的建立效果進(jìn)行準(zhǔn)確的評價。

隨著血管內(nèi)介入方法制作血栓模型的開展，這種方法雖然有接近臨床發(fā)病和治療的優(yōu)點(diǎn)，但是仍然存在血栓模型定位不夠精準(zhǔn)，血栓延伸、血栓自溶等不確定因素[14]，仍然需要建立一套完善的模型評價體系。而伴隨磁共振技術(shù)向著高場強(qiáng)及超高場強(qiáng)、高梯度性能和多種圖像對比的發(fā)展，為血栓梗死及溶栓模型的評價提供了豐富的信息，對于評價體系的建立有極大的幫助。今后的研究應(yīng)采用更多的磁共振技術(shù)，如磁共振灌注成像PWI及磁共振磁敏感成像SWI等，在定性評價的同時還能定量地評價血栓模型。

近些年來，聯(lián)合動脈選擇性低溫灌注技術(shù)，在臨床上仍處于初步的研究階段。目前，已有研究人員應(yīng)用于豬及犬等的動物模型上[15-16]，取得了較為積極的治療效果。能否在非人靈長類動物模型中得到驗證，將是下一步研究的重點(diǎn)。

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