宋早文， 張裕豐， 方金勇， 郭一孚， 劉越丹， 徐玲玲， 趙鐵軍

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

成人T細胞白血病(ATL)是一種惡性淋巴系統(tǒng)增殖性疾病[1].人類T淋巴細胞白血病1型病毒(HTLV-1)的感染與ATL的發(fā)生密切相關[2-3].迄今為止，尚無有效的預防及治療ATL的手段[4].近30年的研究表明，HTLV-1編碼的病毒蛋白在促進病毒感染復制、進而誘發(fā)成人T細胞白血病的過程中扮演極為重要的角色[2-3,5-6].因此，探索直接以HTLV-1病毒蛋白為靶點的新型療法成為攻克該疾病的關鍵.

HTLV-1病毒基因組除正向編碼結構基因gag，pol，env外，位于3’LTR和env之間的pX區(qū)還編碼一系列調節(jié)基因Tax，Rex，p12，p13，p30和HBZ等,其中HBZ蛋白由HTLV-1反義鏈編碼[7-8].HBZ蛋白包含3個功能結構域：N末端激活結構域(AD domain)，C末端堿性亮氨酸拉鏈結構域(bZIP domain)，以及位于中間的中央結構域(CD domain)[9-10].研究證明，HBZ蛋白的致癌功能通過其亮氨酸拉鏈結構域參與調節(jié)多條細胞信號傳導途徑得以實現(xiàn)[11-16].綜合以上信息，本研究人工合成能有效封閉HBZ bZIP功能的靶向多肽——HBAP(HBZ bZIP associate peptide)，并通過多聚精氨酸穿膜肽R8將HBAP攜帶入白血病細胞，觀察其對腫瘤細胞惡性增殖起關鍵作用信號通路的抑制作用，最后運用MTT實驗及流式細胞術觀察該靶向多肽對白血病細胞的殺傷作用.這一研究成果將為我們研發(fā)抗病毒的藥物提供一個全新的思路與策略.

1 材料與方法

1.1 細胞株和靶向多肽

成人T細胞白血病細胞株ATL-T，ATL-2，急性T細胞白血病細胞株Jurkat及人胚腎細胞293FT細胞，皆由日本京都大學松崗雅雄教授惠贈.

靶向多肽R8-HBAP：購于百奇生物科技(蘇州)有限公司.

1.2 主要試劑與儀器

細胞培養(yǎng)基DMEM，RPMI-1640，胰蛋白酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；抗體購自于Santa Cruze公司；胎牛血清購自法國Biowest公司；二甲基四氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；細胞凍存液Cellbanker購自上海微科生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒及質粒大提試劑盒購買自Promega公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術公司；丙烯酰胺、甘氨酸、苯甲基磺酰氟(PMSF)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍G-250和R-250、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TrionX-100、脫脂奶粉等均購于生工生物工程(上海)股份有限公司.

生物安全柜、3111型CO2培養(yǎng)箱：Thermo公司；1500型全自動酶聯(lián)免疫檢測儀：美國熱電公司.

1.3 細胞培養(yǎng)和藥物處理

白血病細胞株(Jurkat、ATL-T和ATL-2)及人胚腎細胞293FT細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清和雙抗(青、鏈霉素，100 IU/mL)的RPMI-1640和DMEM完全培養(yǎng)基中.細胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱及飽和水蒸氣條件下常規(guī)培養(yǎng)及傳代，使用對數(shù)生長期細胞進行實驗.

1.4 MTT法檢測細胞活力

對數(shù)生長期的白血病細胞制成細胞懸液后，按1×105個/mL的密度接種于96孔板，90 μL/孔，以10 μL/孔的量加入0.05 mg/mL的靶向多肽R8-HBAP溶液，置于細胞培養(yǎng)箱分別孵育0，24，48，72和96 h后，加入MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h后，加入100 μL裂解液室溫振蕩處理15 min.在595 nm波長下檢測OD值.

1.5 雙熒光素酶報告基因實驗

表達HBZ和c-Jun蛋白的質粒及AP-1報告基因質粒共轉染Jurkat細胞，再經(jīng)靶向多肽處理細胞48 h后，裂解細胞，提取總蛋白.應用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測報告基因數(shù)值.

1.6 免疫共沉淀技術分析蛋白結合情況

靶向多肽處理轉染有HBZ和c-Jun蛋白的293FT細胞，48 h后提取細胞的總蛋白.20 μL Protein G預處理1 mg總蛋白樣品30 min后，收集上清蛋白，加入FLAG抗體，4 ℃旋轉混勻1 h，再加入20 μL Protein G，4 ℃旋轉混勻1 h.結合有抗體及目的蛋白的Protein G經(jīng)過洗滌緩沖液漂洗5次后，煮沸變性，Western blot檢測目的蛋白的表達水平.

1.7 統(tǒng)計方法

采用Origin 8.5軟件作圖，SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗，“*”P<0.05表示統(tǒng)計學上有顯著性差異；“**”P<0.01表示統(tǒng)計學上有極顯著性差異.

2 結 果

2.1 HBZ bZIP卷曲螺旋結構域分析

HTLV-1編碼的病毒蛋白HBZ，其N端含有與c-Fos相似的亮氨酸拉鏈結構域，這一結構域參與了HBZ與c-Jun等亮氨酸拉鏈相關蛋白(JunB, JunD等)的互作，并影響了HBZ致癌功能的發(fā)揮[11-13].針對這一結合特性，靶向設計并合成能阻遏HBZ與c-Jun相關蛋白結合的多肽，將為治療ATL提供新的技術和有效的手段.

c-Jun和c-Fos形成的復合物對細胞生命活動具有重要作用，因此，該靶向多肽不能干擾細胞Fos-Jun蛋白復合物的形成(見圖1)[17-18].然而，由于HBZ與Fos的亮氨酸拉鏈結構域具有較高的相似性，這給設計針對HBZ的抑制性多肽帶來一定的困難.HBZ和c-Fos與c-Jun相關蛋白之間的結合主要有賴于亮氨酸拉鏈結構域中的卷曲螺旋二聚體的形成(見圖2).在以亮氨酸拉鏈結構為基礎的異質二聚體中，結構域中的e位點和g位點之間的靜電互作起到關鍵性作用.e—g位點之間的結合特性也成為設計人工異質二聚體的基礎[19-20].然而，HBZ和c-Fos蛋白在e位和g位中電荷分布極其相似，均為g位點上有4個谷氨酸(Glu)，e位點上有2個谷氨酸和其他中性氨基酸(見圖2).

圖1 設計能抑制HBZ蛋白功能的靶向多肽HBAP

圖2 HBZ，c-Jun及c-Fos的卷曲螺旋結構域分析

此外，對c-Jun-c-Fos復合體的X射線單晶衍射分析和對卷曲螺旋肽測算分析顯示，a位點和g位點的互作也可能是一個比較重要的因素.因此，根據(jù)亮氨酸拉鏈結構域中的a—g位點互作，筆者成功設計了基于c-Jun序列的突變型的亮氨酸拉鏈片段HBAP.這一片段的顯著特點在于它對HBZ亮氨酸拉鏈的親和性明顯高于對c-Fos亮氨酸拉鏈的親和性.

2.2 設計并合成靶向多肽R8-HBAP

結合上述設計原則，并在上述熱力學分析的基礎上，根據(jù)CANDI-PCA理論設計了6個能與HBZ蛋白bZIP結構域形成二聚體的多肽序列，并在每個多肽的C末端添加8個精氨酸R8的細胞穿膜肽(見表1).多聚精氨酸是一類人工合成的短肽，它由8個精氨酸殘基構成，蛋白轉導活性極強，可作為一種有潛力的藥物輸送載體.為了避免多肽之間發(fā)生相互作用，維持蛋白的構象及其生物學活性，在HBAP和R8序列間引入一個可彎曲的間隔區(qū)Acp.

表1 靶向多肽R8-HBAP序列

2.3 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ與c-Jun蛋白互作

隨后，筆者研究了R8-HBAP是否能有效地與HBZ蛋白結合，從而干擾HBZ蛋白與c-Jun蛋白的互作.表達HBZ和c-Jun蛋白的載體pcDNA3-mycHis-HBZ和pCMV-HA-c-Jun共轉染至293FT細胞，6 h后分別加入不同序列的R8-HBAP.處理48 h后，裂解細胞，免疫共沉淀實驗檢測蛋白結合情況.實驗結果如圖3所示，HBZ蛋白能與c-Jun蛋白結合，然而處理R8-HBAP后，多數(shù)靶向多肽均未呈現(xiàn)抑制效果，1b，2b和2c片段能顯著抑制HBZ-c-Jun蛋白復合物的形成.后續(xù)研究中，將使用1b，2b和2c號靶向多肽進一步分析其抑制功能.

圖3 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ與c-Jun蛋白的結合

圖4 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ對AP-1信號通路的調控作用

2.4 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ對AP-1信號通路的調控作用

為了進一步研究R8-HBAP對HBZ調控的AP-1信號通路的作用，筆者采用了雙熒光素酶報告基因技術.將HBZ和c-Jun表達質粒分別轉染到對應組別的Jurkat細胞中,轉染6 h后處理R8-HBAP,48 h后收集細胞，運用報告基因檢測儀檢測熒光值，結果如圖4所示，HBZ可顯著抑制由c-Jun激活的AP-1信號通路.當加入R8-HBAP后，HBZ對AP-1信號通路的抑制作用明顯被抵消.該結果進一步證明，R8-HBAP能通過與HBZ結合，從而干擾HBZ與其他亮氨酸拉鏈蛋白的結合，進而影響到下游的信號通路.

2.5 靶向多肽R8-HBAP抑制白血病細胞惡性增殖

運用MTT技術分析R8-HBAP是否可以通過抑制HBZ的功能，從而影響白血病細胞的惡性增殖.MTT檢測細胞活力發(fā)現(xiàn)，感染有HTLV-1病毒的ATL-T和ATL-2細胞在檢測的96 h內細胞生長旺盛，但R8-HBAP的加入可以顯著抑制白血病細胞ATL-T和ATL-2的惡性增殖(見圖5).該結果證明，R8-HBAP可以通過與HBZ互作影響HBZ下游調控信號通路，最終抑制白血病細胞的生長.

圖5 HBAP抑制白血病細胞惡性增殖

2.6 R8-HBAP靶向多肽促進白血病細胞凋亡

為了進一步檢測靶向多肽是否影響腫瘤細胞凋亡，筆者對多肽處理后的細胞進行Annexin V/7-AAD染色，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，HBAP-1b多肽可誘導25.83%的ATL-T細胞發(fā)生凋亡.同樣，HBAP-1b靶向多肽作用ATL-2細胞24 h后，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，處理組細胞凋亡比率明顯提高(見圖6).

圖6 HBAP誘導白血病細胞凋亡

綜上所述，R8-HBAP可以通過抑制其蛋白結合能力，顯著抑制白血病細胞惡性增殖，并促進細胞凋亡.

3 討 論

20世紀70年代人們首次發(fā)現(xiàn)成人T細胞白血病(ATL)，并證明人類T淋巴細胞白血病1型病毒(HTLV-1)與ATL的發(fā)生密不可分.至今的三十多年間，圍繞ATL及HTLV-1開展的病毒學、免疫學和分子生物學上的研究取得了突破性的進展.然而在臨床上，缺乏有效的治療手段，預后效果不理想仍然是我們面臨的最棘手問題.目前治療ATL的方法主要包括化療和干擾素治療，但是療效均不明顯.其主要原因在于：1)在長期使用藥物后，ATL細胞容易產(chǎn)生耐藥性；2)ATL病人呈現(xiàn)免疫缺陷狀態(tài)，易于遭受機會性感染[4].

HTLV-1和HIV同屬于逆轉錄病毒家族.HTLV-1編碼的病毒蛋白在促進感染細胞復制、誘發(fā)成人T細胞白血病的過程中起到舉足輕重的作用.日本京都大學Matsuoka教授第一個深入研究了HBZ蛋白的功能，并闡明了它與ATL發(fā)病密切相關[21].研究發(fā)現(xiàn)HBZ是HTLV-1編碼產(chǎn)物中唯一一個持續(xù)表達且不存在無義突變的基因.HBZ基因的缺失會顯著抑制HTLV-1感染細胞的增殖能力.此外，HBZ蛋白參與調節(jié)多條細胞信號傳導途經(jīng)，進而促進T細胞分化，抑制宿主免疫反應，最終導致全身性炎癥反應和T細胞淋巴瘤的發(fā)生[9-10].研究發(fā)現(xiàn)，HBZ蛋白通過其AD和bZIP結構域與NF-κB p65亞基結合，從而抑制經(jīng)典NF-κB信號通路[16].此外，HBZ蛋白的AD和bZIP結構域可協(xié)同抑制C/EBPα，從而促進腫瘤細胞惡性增殖[14].另外有研究顯示，HBZ蛋白通過其bZIP結構域與CREB，CREB2和p300/CBP形成蛋白復合物，負向調節(jié)Tax介導的病毒轉錄.此外，HBZ bZIP結構域可與c-Jun，JunB及JunD相互作用調節(jié)AP-1途徑，從而幫助病毒逃避免疫攻擊，抑制由病毒過度復制引起的宿主死亡[9-10].這些結果均表明，HBZ蛋白的持續(xù)表達在ATL發(fā)病機制中有著重要的意義.在這一系列過程中，HBZ bZIP結構域通過與多種轉錄因子結合的方式參與調控細胞內信號通路，進而導致白血病的發(fā)生.HBZ蛋白尤其是bZIP結構域在HTLV-1致癌過程的重要作用，為研究和開發(fā)ATL治療措施提供了重要的靶點和線索.

因此，探索直接以HBZ蛋白作為靶點的新型治療方法成為攻克該疾病的關鍵.這些病毒蛋白不僅成為區(qū)分感染細胞和正常細胞的重要標志，也成為腫瘤治療藥物的良好作用靶點.利用這一特點研制出一系列腫瘤靶向藥物，如單克隆抗體、反義寡核苷酸等.但細胞膜具有選擇滲透性，生物大分子藥物無法通過細胞膜進入細胞內，而存在于細胞外的藥物很難直接影響細胞內的生物反應，因此，促進藥物穿透細胞膜的研究變得非常重要.

細胞穿膜肽(CPP)是一類具有細胞穿透功能的短肽的統(tǒng)稱，一般少于30個氨基酸，它可以向細胞內運送各種自身不能穿越細胞膜的大分子生物活性物質，為生物治療提供了一個嶄新的有力工具.細胞穿膜肽在腫瘤治療中的應用通常是將各種腫瘤特異性的治療物質靶向運輸?shù)侥[瘤組織及細胞內，從而起到抑制腫瘤細胞增生，促進腫瘤細胞凋亡的作用.CPP通過運送腫瘤特異性的治療物質在一定程度上克服了腫瘤治療缺乏靶向導入這一困難，提高了藥物的利用效率，減少藥物引起的毒副作用.目前已有許多關于應用CPP介導抗腫瘤藥物顯著抑制腫瘤細胞惡性表型，成功治療腫瘤動物模型的報道[22].

通過本研究，首次以HTLV-1關鍵病毒蛋白HBZ為靶點研發(fā)治療方法，找準了誘發(fā)ATL的關鍵因素，這一靶向治療手段解決了傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物對正常細胞的毒副作用.該研究為今后研究及設計抗HTLV-1和ATL的藥物提供了一個全新的思路與策略.

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