陳曉燕 姜雯雯 房春娟

【摘 要】目的：比較梔子苷四種不同給藥途徑治療大鼠腦缺血損傷的藥效。方法：成年雄性 SD 大鼠，隨機(jī)分成假手術(shù)對(duì)照組、模型組、梔子苷組iv給藥組、梔子苷im給藥組、梔子苷ig組、梔子苷ns給藥組。使用血管腔內(nèi)尼龍線栓塞術(shù)造成大鼠持久性大腦中動(dòng)脈栓塞（PMCAO），制作腦缺血模型，應(yīng)用TTC染色、免疫組化法、病理超微組織觀察綜合評(píng)價(jià)，比較梔子苷不同給藥途徑的治療腦缺血疾病的藥效。結(jié)果：ns給予梔子苷溶液后大鼠體重修復(fù)較好，能顯著降低腦缺血模型大鼠的腦含水量、腦梗死面積、血清中NOS及MDA的含量，提高血清中SOD的含量，腦組織病理切片觀察腦組織壞死及水腫處也有明顯改善，與模型組及其它給藥組之間存在著顯著性差異。結(jié)論：ns給予梔子苷后能夠顯著修復(fù)部分腦組織細(xì)胞的活性及改善其病理情況。

【關(guān)鍵詞】梔子苷；腦缺血損傷；不同給藥途徑；藥效學(xué)

Abstract Objective： To compare four different routes of administration Jasminoidin efficacy of treatment of ischemic brain injury. Methods： Adult male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Geniposide group iv administration group， Geniposide im administration group， Geniposide ig group， Geniposide ns administration group. Use nylon line endovascular embolization in rats caused by persistent middle cerebral artery occlusion （PMCAO）， the production of cerebral ischemia model， applications TTC staining， immunohistochemistry， tissue pathology observed ultrafine comprehensive evaluation， comparison of different routes of

administration Geniposide cerebral ischemic disease treatment efficacy. Results： Ns after the body

weight of rats given Geniposide repair solution is better， can significantly reduce cerebral ischemia in rats brain water content， infarct size， NOS and MDA content in serum， increase in serum SOD， and brain pathology slices of brain tissue necrosis and edema were observed also at a significant improvement， there are significant differences between the administration and the model group and other groups. Conclusion： Ns give Geniposide can significantly repair some brain cell activity and improve their pathology.

Key words： Geniposide； cerebral ischemic injury； different routes of administration； pharmacodynamics

【中圖分類號(hào)】R969.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-3783（2017）11-03-0-01

我國(guó)約有170萬(wàn)人因腦卒中死亡，大多數(shù)腦卒中患者發(fā)病后會(huì)留下癱瘓或其他嚴(yán)重后遺癥[1]。腦卒中可分為缺血性和出血性兩類，缺血性中風(fēng)的發(fā)病率占到75%-85%，比出血性中風(fēng)高很多。因此，防御和治療腦缺血性中風(fēng)疾病成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)研究對(duì)象。許多種藥物在臨床前研究結(jié)果較理想，但應(yīng)用到臨床的結(jié)果卻不盡人意。所以尋找預(yù)防效果好及療效確切的腦缺血損傷防治藥物，仍是我們研究的重要任務(wù)?，F(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為，腦中風(fēng)可以用清熱解毒法進(jìn)行治療，清熱解毒法能打通人的經(jīng)絡(luò)，讓人體內(nèi)的氣血津液的均勻分布，同時(shí)能營(yíng)養(yǎng)腦組織。梔子苷為清開(kāi)靈復(fù)方中梔子的有效成分之一，有研究證明[2]梔子苷具有清熱去火、涼血解毒的功效，對(duì)大鼠腦缺血/再灌注具有一定的保護(hù)作用，對(duì)腦缺血類疾病有良好的防治作用。

本研究以線栓法復(fù)制大鼠腦缺血模型，根據(jù)臨床上常用的iv、im、ig、ns四種不同給藥途徑給予梔子苷，檢測(cè)其腦含水量、腦梗死面積、血清中SOD、NOS及MDA的含量，以及對(duì)腦組織病理切片進(jìn)行觀察，比較其不同給藥途徑的治療腦缺血損傷的藥效優(yōu)勢(shì)，為梔子苷臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

雄性大鼠90只，每組15只，體重（260±20）g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（贛）2015-0001，實(shí)驗(yàn)期間飼以固體飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水）。

1.1.2 藥物及試劑

梔子苷（德思特生物科技有限公司，含量96.2%，批號(hào)：syz090911）；魚線：（4-0號(hào)，自購(gòu)于漁具商店）；SOD、MDA、NOS試劑盒（南昌建成生物有限公司）；水合氯醛（上海品純?cè)噭┯邢薰荆?；肝素鈉（Solarbio 試劑公司）；TTC：氯化2，4，5—三苯基四氮唑（中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)：20030325）；多聚甲醛（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；甲醛溶液（汕頭市西隴化工廠有限公司）；其余試劑（分析純，市售）；雙蒸水（自制）。

1.1.3 儀器

SIGMA3-18K型高速冷凍離心機(jī)（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）；722可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；恒溫水浴箱（常州國(guó)華電器有限公司）；超聲清洗器（上海必能信超聲有限公司）；超純凈水發(fā)生器（美國(guó)Miliipore公司）；微量移液器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

采用線栓法制備腦缺血模型，分別ig、iv、im、ns給予（25mg·mL-1）梔子苷溶液，選用腦含水量及腦梗死面積、SOD、MDA、NOS為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較其藥效，從而篩選合適的給藥途徑。

2.1 分組及給藥

動(dòng)物隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、梔子苷ig、iv、im、ns組、每組大鼠給三次藥，分別是手術(shù)前給藥一次、術(shù)后4小時(shí)給第二次、12小時(shí)給第三次，24小時(shí)后處死大鼠，取腦。

2.2 動(dòng)物模型的制備

2.2.1 栓子制備

將直徑為0.25mm尼龍線切制成等長(zhǎng)大約40mm的線段。將尼龍線的一端靠近酒精燈進(jìn)行燙鈍至呈鼓錘狀，使其頭端光滑圓鈍，尖端或不規(guī)則狀則棄用。取頭端直徑為0.26-0.30mm的線栓用酒精滅菌，并用0.9%的氯化鈉溶液沖洗，肝素浸潤(rùn)后備用。

2.2.2 模型的建立

參照Longa等[3]和羅勇等[4]報(bào)道的方法，假手術(shù)組只分離CCA、ICA、PPA而不插線結(jié)扎。在操作過(guò)程中，手術(shù)中均需以白熾燈對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行加熱保溫，同時(shí)需保持25-28℃的室內(nèi)溫度溫。在分離動(dòng)脈過(guò)程中要保護(hù)沿著頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈走行的迷走神經(jīng)，避免造成氣管損傷。否則會(huì)使大鼠呼吸道阻塞，嚴(yán)重時(shí)窒息死亡。

2.3 標(biāo)本采集

2.3.1 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分

參照l(shuí)onga的評(píng)分方法，手術(shù)24h后對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分為0與4分的大鼠棄之不用。

2.3.2 血清的采集

大鼠麻醉后，心臟取血，將血放于100×12mm塑料試管中， 4℃冰箱內(nèi)靜放2小時(shí)，血液凝固后，離心機(jī)離心5min，取上清液血清至EP管中，-20℃冰箱保存待測(cè)。

2.3.3 腦梗死面積的測(cè)定

大鼠缺血24h后，立即斷頭處死，取出腦組織。用生理鹽水沖洗，將其放置于-20℃的冰箱中冷凍15分鐘左右，將其切成2mm左右的切片，將其切片置于2%的TTC生理鹽水溶液中，在37℃下孵育約30分鐘，后將其鋪開(kāi)并拍照。先用photoshop軟件處理圖片，再用Osiris 4軟件算面積。另取部分大鼠腦組織置于冰盤上，沿大腦中動(dòng)脈梗死區(qū)中心冠狀切4mm厚的切片，放于10%福爾馬林中固定，備用做病理切片。

2.3.4 腦組織含水量的測(cè)定

快速剝出大鼠腦組織。稱重，然后置于100℃左右的烘箱內(nèi)烘干至恒重，將烘干的腦組織進(jìn)行稱重示為干重。按公式計(jì)算腦含水量。含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

2.3.5 HE染色

動(dòng)物深度麻醉后，取其腦組織，將腦組織將其用生理鹽水和40g/L的多聚甲醛固定液灌注固定，之后用200g/L蔗糖保存沉底過(guò)夜，切片機(jī)切片，常規(guī)HE染色。

2.4 試劑盒的測(cè)定

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行SOD、NOS及MDA試劑盒的操作，并用722可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用spss16.0for windows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 表示，采用one Way-ANOVA、Independent Samples Test進(jìn)行組間比較，采用Excel 2010作圖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 神經(jīng)學(xué)評(píng)分

造模缺血24h后采用Longa的評(píng)分方法評(píng)分，結(jié)果顯示假手術(shù)對(duì)照組：0分；造模缺血組：2-3分；造模組與假手術(shù)組比較有極明顯的差異（p<0.01）。給藥組與模型組比較無(wú)明顯差異。說(shuō)明造模成功。

3.2 藥效指標(biāo)考察

梔子苷對(duì)大鼠腦缺血/再灌注具有保護(hù)作用，能降低腦組織MDA，NOS含量及升高SOD活性。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 不同給藥途徑的大腦病理切片HE染色圖

由圖1可看出，腦組織形態(tài)學(xué)觀察光鏡下假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞、血管等未見(jiàn)損害性改變；模型組缺血中心區(qū)可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞壞死征象，表現(xiàn)為細(xì)胞呈三角形或多角形，細(xì)胞固縮深染，核仁消失，細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、深染，呈嗜酸性改變，并呈現(xiàn)明顯水腫樣；Im及ns組細(xì)胞形態(tài)較模型組有所改善，但局部有點(diǎn)散在毛細(xì)血管外滲血；ig組梗死區(qū)毛細(xì)血管外滲血嚴(yán)重；iv組的缺血區(qū)有輕微水腫，細(xì)胞核仁保存的較好，可見(jiàn)散在少許神經(jīng)細(xì)胞壞死征象。

4 結(jié)論

4.1 流行病學(xué)研究表明[5]，雌激素與缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。也有研究證明，雌激素替代療法對(duì)于腦缺血后的腦損傷有改善作用[6]，故實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用雄性大鼠，盡量減少其對(duì)藥物的干擾。

4.2 本實(shí)驗(yàn)對(duì)梔子苷在臨床上常見(jiàn)的四種給藥方式的對(duì)腦缺血損傷疾病的藥效學(xué)進(jìn)行了研究

4.3 大腦腦缺血后梗死部分細(xì)胞會(huì)壞死及局部會(huì)出現(xiàn)水腫，腦含水及腦梗死面積可以宏觀評(píng)判腦缺血損傷程度的大小。給予梔子苷后能夠修復(fù)部分腦組織細(xì)胞的活性及減少腦含水量，其腦梗死面積大小順序?yàn)椋耗Ｐ徒M>ig組>im組>ns組>iv組，腦含水大小為：模型組>ig組>iv組>ns組≈im組，結(jié)果可以推測(cè)出iv與ns組對(duì)于大鼠腦缺血的治療效果較好。

4.4 腦缺血時(shí)，血清中MDA、NOS、NO明顯上升（均P<0.01），SOD明顯下降（p<0.01），其發(fā)生機(jī)理可能為腦缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流從而使細(xì)胞內(nèi)鈣離子多，激活了NOS，使NO明顯升高。MDA為氧自由基生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化可間接反映組織中氧自由基含量的變化。在腦缺血期間，氧自由基大量生成，MDA升高，SOD活性會(huì)明顯下降，本試驗(yàn)結(jié)果顯示梔子苷具有改善腦缺血損傷的作用。其含量大小順序?yàn)椋篠OD：模型組ig組>im組>ns組>iv組；MDA：模型組>ig組>ns組≈im組>iv組，故可推測(cè)出iv給藥后對(duì)因子的調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)，故可間接說(shuō)明其藥效最好，其次是ns及im組。

綜上可看出，梔子苷不同四種給藥方式對(duì)腦缺血再灌注損傷中的各因子均具有調(diào)節(jié)作用，且與模型組相比具有顯著性差異，故梔子苷用于臨床上治療腦缺血再灌注具有一定的可行性。

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