張曉寧，尚一娜，陳境，霍麒文，李明慧，楊姝玉，邢葉妮，王俊國

（內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

肉制品是人類飲食的重要組成部分，含有豐富的營養(yǎng)價值，極易受到腐敗微生物的污染，造成肉制品腐敗變質，給消費者的健康帶來隱患。目前我國肉類加工行業(yè)存在冷鏈系統(tǒng)不健全、使用化學防腐劑等問題，長期食用會對人體產生毒副作用[1]。食品添加劑通用標準（Codex General Standard for Food Additives，GSFA）批準添加亞硝酸鹽、有機酸及其鹽類作為肉類和肉類產品的添加劑，此外肉制品企業(yè)還可以采取冷凍、冷藏、熱加工、腌制、干燥、發(fā)酵、煙熏等物理手段對肉制品進行加工，但這不可能完全抑制肉制品中腸桿菌、假單胞菌，乳桿菌等腐敗菌的生長，因此天然食品級生物防腐劑的出現為肉制品的防腐保鮮提供一種新的可能。乳酸菌（Lactobacillus）在食品中的應用由來已久，是一種公認的食品級微生物，通過乳酸菌發(fā)酵的食物不僅營養(yǎng)及風味有所改變，其抑制腐敗菌的作用也大大增強，研究發(fā)現這種抑菌作用不僅取決于乳酸菌產酸，而且也與乳酸菌分泌的細菌素有密切聯系。細菌素作為乳酸菌的代謝產物被認為是一種天然食品防腐劑，其具有安全性高、防腐作用強以及不會改變食品原有感官品質等優(yōu)點，因而被廣泛應用于肉制品中，以延長肉類的保質期和提高其安全性。本文重點對乳酸菌細菌素分類、生物合成途徑、機制及其在肉制品防腐方面的應用進行綜述。

1 乳酸菌細菌素及其分類

1.1 乳酸菌細菌素

乳酸菌細菌素是乳酸菌代謝過程產生的一類具有抗菌活性的小分子肽類物質[2]，大多是以30～60個氨基酸組成的小分子形式存在。多數產細菌素的乳酸菌是從食品中分離所得，可被人體內蛋白酶降解，對腸道微生物群不會產生太大影響，被大家公認為是安全無毒的（GRAS），因而常被用作食品防腐劑。截止到2015年，產細菌素的乳酸菌多達185株[3]。

1.2 乳酸菌細菌素的分類

目前乳酸菌細菌素的分類主要是基于細菌素的氨基酸結構及其理化性質，Cotter等根據細菌素分子中是否含有羊毛硫氨基酸、分子量大小及是否對熱穩(wěn)定，將乳酸菌細菌素分為三大類，即I類羊毛硫細菌素、II類細菌素及Ⅲ類細菌素，II類細菌素進一步可分為IIa，IIb，IIc 和 IId 4 個亞類[4]，見表1。

表1 乳酸菌細菌素的分類Table 1 Classes of bacteriocins from lactic acid bacteria

Ⅰ類細菌素是指含有羊毛硫氨酸、對熱穩(wěn)定、對革蘭氏陽性菌有較寬抗菌譜（葡萄球菌，鏈球菌，李斯特菌屬，桿菌和腸球菌）的一組小分子多肽（分子量＜5 kDa）。1928年Rogers較早發(fā)現乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）能夠產生乳酸鏈球菌素 A[13]；1944年Hirsch發(fā)現乳酸鏈球菌（Streptococcus acidi lactici）代謝產物具有抑菌活性，且這種抑菌活性物質具有類似蛋白質的結構和性質，是Ⅰ類細菌素的主要代表并命名為Nisin[14]；隨著分子手段的不斷進步，2010年Mkrtchyan等從嗜酸乳桿培養(yǎng)基中分離得到了分子量大小只有1.15 kDa的Ⅰ類細菌素，發(fā)現其氨基酸序列為Asn－Val－Gly－Val－Leu－X－Pro－Pro－X－Leu－Val[15]。

II類細菌素不含羊毛硫氨酸、對熱不穩(wěn)定，包括IIa，IIb，IIc和IId 4個亞類。IIa類細菌素是II類細菌素中主要的亞種，抗菌譜相比Ⅰ類細菌素較窄，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）產生的乳酸片球菌素（pediocin PA1）為主要代表，2014年Perez等與2015年O'Oconnor等相繼研究發(fā)現IIa類細菌素僅對乳酸菌、李斯特菌等革蘭氏陽性菌表現出抗菌活性，但也存在極少數對大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性細菌表現抗菌活性[16－17]。IIb類細菌素是由兩種不同的肽分子組成的多肽，當每種肽的肽比率相等時才會發(fā)揮協(xié)同作用，產生最佳抗微生物活性[18]，乳球菌素G（lactococcin G）和萵苣苦素F（lactacin F）是首次報道的雙肽細菌素。此外，1998年Anderssen等從阿根廷發(fā)酵香腸分離出了乳桿菌素705（lactobacillin 705），是肉制品中報道中的第一種Ⅱb型細菌素，同時發(fā)現乳桿菌素705對其他乳酸菌和嗜熱菌具有拮抗作用[19]。2014年Perez等指出該類別還包括乳球菌素Q（lactococcin Q），腸道菌素 X（enterocin X）和腸道菌素 NKR－5－3AZ（enterocin NKR－5－3AZ）等[16]。Ⅱc 類細菌素的分子主鏈具有頭－尾環(huán)化的結構特征，到2015年為止，已經從嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發(fā)現多種環(huán)狀菌素，包括腸道菌素 AS－48（enterocin AS－48），加薩霉素（gassericin A）等[20]。Ⅱd類細菌素包括非單線性肽，sec依賴性細菌素以及具有N－末端前導序列，并在翻譯后立即有活性的無前導序列細菌素[21]。2015年Worapravote等從泰國發(fā)酵豬肉香腸（nham）中分離出兩種Ⅱd新型細菌素，即Bac7293A和Bac7293B[18]，兩種細菌素均抑制廣譜細菌，包括單增李斯特菌，金黃色葡萄球菌，鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌以及食物腐敗銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌。其抗菌活性均可以被蛋白水解酶（胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K）水解，但有機溶劑（乙醇，異丙醇，乙腈）和表面活性劑（Tween 20，Tween 80和Triton X-100）均不影響其抗微生物活性。此外從Bac7293A的C-末端螺旋輪看出，細菌素具有較高的平均疏水性（H=0.516）和凈電荷（PI=9.99），這在抗微生物活性中起到主要的作用，這與1999年Dathe等就已經發(fā)現細菌素疏水性越強其抗菌活性就越強，表面正電荷越多與靶細胞附著就越容易的結論相對應[22]，可見細菌素分子結構的疏水特性與表面電荷對于細菌素產生抗性是非常重要的兩項指標。

III類細菌素由熱不穩(wěn)定性蛋白質組成，分子量大于30 kDa，以維生素J為主要代表，此外還包括lysostaphin，enterolysin A，helveticin J 等[8，12]。

2 乳酸菌細菌素的生物合成途徑

乳酸菌細菌素的生物合成由相關基因調控，包括結構基因、對自身產生免疫的基因、ABC轉運蛋白基因及運輸細菌素的輔助蛋白基因[23]。其中結構基因是細菌素編碼基因，其可能存在于染色體上或質粒上，還有可能同時存在于染色體和質粒上。貢漢生等從傳統(tǒng)乳制品分離得到植物乳桿菌KLDS1.0391，對其產生的細菌素進行編碼基因定位研究，結果顯示：原始菌株和消除質粒的衍生菌株對枯草芽孢桿菌都具有明顯的抑菌活性，因此判斷植物乳桿菌KLDS1.0391的編碼細菌素基因不位于質粒上，而是位于染色體上[24]。

但在一些研究中發(fā)現有些乳酸菌在質粒消除或轉移后，其不再分泌細菌素，這表明細菌素的編碼基因可能位于質粒上。1998年李平蘭等發(fā)現細菌素的遺傳因子不是位于染色體DNA中，而是由獨立于染色體的質粒進行編碼[25]，Van Reenen等采用質粒消除法對細胞某種特征是否由質?？刂七M行探討，用新生霉素處理植物乳桿菌Lb.plantatum 423消除了大小約為6 kb左右的質粒，通過抑菌試驗證明其失去產生細菌素Plantaricin 423的能力，因此該菌株編碼Plantaricin 423有關的基因初步定位于該菌株6 kb左右的質粒上，與染色體無關[26]。

進一步的研究發(fā)現同一菌株可以產生不同的細菌素，其細菌素的編碼基因存在的部位也不相同，如植物乳桿菌產生植物激素（Plantaricin ST31）時，其遺傳因子是由染色體進行編碼，當產生植物激素（Plantaricin 423）時，其遺傳因子則是由質粒進行編碼。說明當某種細菌產生多種細菌素時，其結構基因可能是由染色體和質粒一起進行編碼[27]。

乳酸菌產生的細菌素需要在細胞內經過一系列修飾加工后，才能具有抑菌活性。新合成的細菌素含有N-末端引物，在細胞內由細菌素基因編碼的蛋白質或氨基酸進行修飾，包括：絲氨酸和蘇氨酸殘基脫水形成硫醚交聯物以及對不飽和氨基酸的磷酸化處理等[7-8]。其中，以I類細菌素（羊毛硫抗生素）中nisin的生物合成為例進行描述：Nisin的基因簇結構復雜，含有11個基因，分別命名為nisABTCIPRKFEG：nisA基因編碼形成nisinA前體多肽；nisB和nisC編碼翻譯后修飾反應相關的酶；nisT編碼ABC轉位運輸蛋白，這個蛋白與Nisin前體的輸出有關；nisP編碼和前體加工處理相關的細胞外蛋白酶；nisI編碼和自身保護作用相關的脂蛋白質；nisFEG可能編碼輸出蛋白；nisR和nisK編碼的蛋白和Nisin生物合成的調控相關[28]，見圖1。另外細菌素的產生不僅僅受到內部基因的表達，還會受到外源誘導因子的調控、菌體生長的溫度和pH值等。

圖1 Nisin基因簇結構示意圖Fig.1 Nisin gene cluster structure diagram

3 乳酸菌細菌素作用機制

乳酸菌細菌素的產生是與其分泌的一種信息素有關的，也是乳酸菌對外在競爭對手的一種條件反射，當外界細菌的數量達到一定值時，乳酸菌產生的信息素就會自動調控乳酸菌素的合成與分泌，從而使乳酸菌在競爭中取得優(yōu)勢地位，見圖2。

圖2 乳酸菌細菌素反饋作用機制Fig.2 Feedback mechanism of bacteriocins from lactic acid bacteria

不同類型的乳酸菌細菌素通過不同的作用機制產生抑菌效果，通常其作用位點是細胞膜，Ⅰ類細菌素作用的最初動力是靶細胞膜和細菌素之間的靜電引力。細菌素吸附到敏感的靶細胞上，與靶細胞壁上的肽聚糖、脂質Ⅱ的前體物質相互作用形成細菌素脂質Ⅱ復合物，之后此復合物插入到腐敗細菌的細胞膜中，使得其細胞膜形成孔洞導致細胞內物質滲漏，最終造成細胞的死亡[29]，見圖3。

圖3 Ⅰ類細菌素抑菌作用機制Fig.3 Antibacterial mechanism of ClassⅠbacteriocins

Ⅱ類細菌素則是通過N端β折疊區(qū)域通過識別位于細胞膜上甘露糖磷酸轉移酶系統(tǒng)（MPTs）N端的胞外環(huán)，其片段PA－1與其受體細菌相互作用[30]，通過靜電作用，乳酸片球菌素的N－末端保守結構域與MPTs相結合，疏水性C－末端結構域滲透進入靶細胞的細胞膜，出現致死孔洞造成離子和小分子的泄露，見圖4。

圖4 Ⅱ類細菌素抑菌機制Fig.4 Antibacterial mechanism of ClassⅡbacteriocinas

另外有研究報道細菌素在對李斯特氏菌抑制過程中，發(fā)現細菌素內部結構存在某些特定構像識別位點，其S形鉸鏈狀結構的不同決定細菌素是否具有抗李斯特菌特性的作用[31－32]。

乳酸菌細菌素在抑菌過程中，不僅僅對靶細胞膜進行破壞，還可能結合靶細胞細胞壁肽聚糖的前體類脂Ⅱ，干擾其細胞壁的合成。主要是因為細菌素表面存在較多正電荷，是活性陽離子吸附劑，具有很強的吸附性，其N－末端帶電殘基與靶細胞的初始靜電結合，影響靶細胞的特異性終止蛋白質的合成[33]，從而阻礙腐敗菌細胞壁的合成，早在2006年Gunnar等的研究中得到了證實，即發(fā)現細菌素表面所帶的正電荷越多，與靶細胞的附著就越容易[34]。

4 乳酸菌細菌素在肉制品中的應用

細菌素因其抗菌作用而得到了廣泛的研究與應用。隨著研究的不斷深入，技術的不斷加強，細菌素在肉品中的應用方式也愈來愈多樣化，目前主要包括如下4種方式。

4.1 產細菌素乳酸菌直接作為發(fā)酵劑

產細菌素乳酸菌作為發(fā)酵劑應用于肉制品中，能夠水解肉中蛋白質，有助于形成風味和色澤，另外乳酸菌代謝產生的酸性物質及抗菌肽類物質可抑制腐敗菌、致病菌的生長，在改善肉制品感官特征的同時起到防腐的作用。2012年Kingcha等利用產細菌素的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）作為發(fā)酵劑來控制發(fā)酵香腸中病原微生物的生長，結果表明接種戊糖片球菌的實驗組與對照組相比，發(fā)酵18 h～24 h內，人為添加的單增李斯特菌明顯減少[35]。2014年Gao等研究發(fā)現將分離自傳統(tǒng)發(fā)酵白菜中的產細菌素乳酸桿菌C2（Lactobacillus）用作香腸的發(fā)酵劑，在香腸發(fā)酵過程中可有效控制成品中單增李斯特菌、腸桿菌的生長，同時有效降低了丙二醛和亞硝酸鹽含量，使產品品質得以改善[36]。此外，國外研究發(fā)現肉中本身的內源性蛋白水解酶會影響產細菌素乳酸菌的生長活性及細菌素的產生，2014年Castro等將產細菌素的乳酸桿菌（Lactobacillus lactis）添加到羊肉中，檢測單增李斯特菌的生長是否受到抑制，結果發(fā)現單增李斯特菌的生長反彈發(fā)生在兩周后，分析其生長及細菌素活性下降的主要原因是隨著時間的延長，肉制品中原有蛋白水解酶逐漸發(fā)揮作用，導致細菌素抗性下降[37]。由此可見，產細菌素乳酸菌作為發(fā)酵劑應用于肉品中仍存在一定的局限性，因此為了降低肉中原有蛋白酶的影響，使用螯合劑（如EDTA）在延遲蛋白酶活性的同時保證細菌素抗菌活性得到良好的發(fā)揮。

4.2 細菌素直接作為防腐劑

將產細菌素的乳酸菌作為發(fā)酵劑應用于肉品中，雖然提高了肉制品的保質期與安全性，但也會帶來一定的缺陷，如肉制品在多菌發(fā)酵系統(tǒng)中，不同乳酸菌產生的細菌素會導致菌株之間拮抗作用的發(fā)生，從而影響肉制品的品質，同時在單菌發(fā)酵過程中，由于菌株生長環(huán)境或營養(yǎng)成分等條件的限制往往會導致菌株不完全發(fā)酵，造成細菌素含量較少而作用效率低等的問題。

為了解決上述問題，在肉制品中直接添加細菌素作為防腐劑成為當前細菌素在肉品中應用主要方式之一。2012年Chen等發(fā)現屎腸球菌（Enterococcus faecium）產生的腸道菌素A和腸道菌素B應用于如熟火腿、碎豬肉及發(fā)酵香腸等不同類型的肉類產品時，可顯著降低無害李斯特菌（Listeria innocua）在冷藏期間的數量[38]。之后2014年Grande等將腸道菌素AS－48，用于制作低酸發(fā)酵香腸來控制病原微生物的生長，結果顯示在成熟結束時（10 d）單增李斯特菌從5.5 lg CFU/g降低到1.19 lg CFU/g，同時對沙門氏菌的抑制作用也比較顯著[39]。為了進一步增強細菌素在肉品中的抗菌作用，2012年Turgis等嘗試將腸道菌素AS－48與高靜水壓方法結合使用，發(fā)現對沙門氏菌抑制作用顯著[40]，這表明通過與其他技術的結合，可以增強細菌素的抗微生物能力，同年Turgis研究發(fā)現屎腸球菌（Enterococcus faecium）產生的細菌素MT104和MT162可降低香腸中單增李斯特菌的數量，與γ－輻照結合使用也會產生抗李斯特菌的協(xié)同效應[40]。另外細菌素還可以與微膠囊化技術結合使用來提高肉產品的安全性。2015年Huq等嘗試將乳鏈菌肽與精油組合使用開發(fā)抗李斯特菌制劑，將抗李斯特菌制劑用藻酸鹽聚合物微膠囊化，發(fā)現在冷藏儲存期間，利用微膠囊化技術處理的肉制品與 γ－照射（1.5 kGy）的肉制品，均表現出對單增李斯特菌的協(xié)同作用。微膠囊化的乳鏈菌肽與γ－照射之后單增李斯特菌每天的生長速率為0.03 lg CFU/g，而非微膠囊化的乳鏈菌肽與γ－照射組合其每天生長速率為0.17 lg CFU/g，微囊化顯著（P＜0.05）提高了乳鏈菌肽的抗菌有效性[41]。綜上說明細菌素能夠用于不同類型肉產品的防腐保鮮，而且與其它技術相結合更是提高了肉制品的安全性。

4.3 將細菌素嵌入肉制品包裝膜中

隨著人們健康意識的增強，將細菌素以防腐劑的形式添加到肉制品中，會使消費者對肉品的接受性降低，Rose等研究發(fā)現在肉制品中直接添加細菌素，會導致其與肉中的谷胱甘肽發(fā)生反應，在導致肉制品營養(yǎng)降低的同時也會造成細菌素失活[42]。為了避免這一現象的發(fā)生，采用細菌素直接摻入到食品接觸材料中的方式，在降低防腐劑使用量的同時也減少了消費者的顧慮。另外，引起肉制品變質的多數腐敗微生物是需氧菌，微生物污染主要發(fā)生在表面，因此可以通過將細菌素摻入肉制品包裝膜中的方式可有效降低其污染程度。

細菌素摻入包裝膜發(fā)揮其抗菌活性受到諸多因素的影響，近年來研究者們不斷改進細菌素摻入到包裝膜中的處理方式，發(fā)現處理溫度是細菌素產生抗性的主要影響因子。2010年Weng等在探討抑制微生物在表面生長材料的可行性時發(fā)現雖然有些細菌素相對耐熱，但是將其以溶劑復合的方式摻入到包裝膜中還是要避免任何形式的熱處理[43]。2011年Sun等發(fā)現流延膜（溶劑配混）乳鏈菌肽的活性是熱壓膜的3倍，通過實驗證實在溶劑混合處理中，應該避免對細菌素或含有細菌素成膜溶液進行熱處理[44]。2016年Beristain－Bauza等將鼠李糖乳桿菌（Lacbobacillus pastorianus）的無細胞上清液在92℃下熱處理30min，加入成纖溶液與未進行熱處理相比，包裝膜的抗菌活性降低[45]，這表明高溫會導致細菌素抗菌活性的損失。研究還發(fā)現包裝膜材質也會影響細菌素抗菌活性，2007年Marcos等將產細菌素的腸球菌摻入到生物降解膜（海藻酸鹽，玉米醇溶蛋白和聚乙烯醇）中，研究其對單增李斯特菌的抗菌作用，其中，含有2000 AU/cm2腸球菌的藻酸鹽膜包裝有效地控制了單增李斯特菌的生長，在15天期間并未觀察到其數量的增加，并在儲存29天之后與其它組相比，藻酸鹽膜包裝組中單增李斯特菌的數量最低，證實了不同類型抗菌包裝對于細菌素的抗性具有不同的作用效果[46]。另外在溶劑混配中，細菌素和膜聚合物需要溶解在相同的生物聚合物中，例如蛋白質和碳水化合物[47]。但也有部分研究者提出將細菌素直接摻入到肉制品包裝膜中可以提高其抗菌活性，但形成的片晶膜形態(tài)特征較差，透明度、厚度和膜機械性質等均有不同程度的下降，因此將細菌素更好的摻入包裝膜還有待進一步的研究。

4.4 細菌素涂層于肉制品包裝膜上

直接將細菌素摻入肉制品包裝中還會帶來細菌素與聚合物間的不相容等問題，因此為了避免以上弊端，嘗試將細菌素作為擴散涂層吸附到包裝表面上，2008年Iseppi等將腸道細菌素作為涂層用于肉制品包裝膜上，來評價對李斯特菌的抗微生物效能，結果顯示冷藏儲存期間與未涂抹腸道細菌素的對照組相比，實驗組在24 h內顯著降低單增李斯特菌的數量，在4℃和22℃的儲存條件下，涂有腸道細菌素膜組的李斯特菌數明顯低于對照組。另外涂覆膜與未涂覆膜相比都具有相同的透明度，雖沒有對塑料膜表面進行任何處理，細菌素涂層對塑料膜仍具有良好的粘附性[48]，可見肉類包裝中將細菌素作為涂層用在食品包裝膜上具有很好的應用前景。之后2015年Argyri等進一步證實在真空條件下將乳鏈菌肽與EDTA組合用于包裝膜中作為牛排的包裝，與未涂抹膜相比涂覆乳鏈菌肽-EDTA的膜顯著降低了腐敗細菌、熱脂菌和肉桿菌屬的數量，很好保持了肉的品質[49]。此外，影響細菌素發(fā)揮作用的因素不僅僅是產品包裝膜表面特性，還包括細菌素的純度，吸附溫度以及吸附時間等，2016年Woraorayote證實商業(yè)乳鏈菌肽對玻璃紙表面的吸附，確實受到吸附溫度的影響，溫度的增加會導致乳鏈菌肽吸附量的減少，并在8℃能夠獲得乳鏈菌肽的最大吸附量[11]，其次乳酸菌產生細菌素的同時所產生的雜質也會影響乳糖對低密度聚乙烯（LDPE）膜的吸附。

5 展望

乳酸菌細菌素在肉制品防腐領域已經充分顯示出其優(yōu)越性，隨著生物技術的發(fā)展，有可能更多的新型細菌素被發(fā)現，使其具有更為廣泛的抑菌活性，從而提高細菌素在肉制品中的應用價值。為了進一步保障人們的身體健康，在實際生產應用細菌素之前，必須要全面了解細菌素的產生，免疫和作用方式的機制，這也是安全和有效利用細菌素的前提。

為了提高細菌素的抑菌作用，可以采用柵欄技術，將細菌素與其他保藏方法聯合使用，如采用溫和非熱物理方法，如脈沖電場、高靜水壓、真空或改性氣調包裝等，也能夠增強細菌素的抗菌活性。目前還有研究顯示可以采用分子生物學方法，通過改變某個特定的氨基酸序列來改變細菌素的抗菌活性。最后，在產品包裝膜中摻入細菌素的創(chuàng)新技術是具有挑戰(zhàn)性的，人們對于開發(fā)抗菌包裝也充滿了期待?？傊S著研究的深入，乳酸菌細菌素這種新型生物防腐劑在肉制品防腐領域必將具有廣闊的市場。

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