朱玉竹，朱萍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學附屬中學，云南昆明650200；2.重慶大學生物工程學院，重慶400044）

瑪咖（Lepdium meyenii Walp，Maca）為十字花科（Brassicaceae）獨行菜屬（Lepidium）草本植物，原產(chǎn)于海拔 3 500 m～4 000 m 的秘魯安第斯山脈（AndesPeru）[1－2]。從2002年我國正式批準引種瑪咖以來，逐漸形成以云南麗江為中心，逐漸輻射至昭通、會澤等云南其他地州及吉林、新疆和湖南等多個省市區(qū)。2011年，國家衛(wèi)生部第31號公告批準瑪咖粉作為“新資源食品”，瑪咖迎來了快速發(fā)展期?，斂Ш胸S富的蛋白質、氨基酸、礦物質、多糖等營養(yǎng)物質和瑪咖烯、瑪咖酰胺等生物堿活性成分，是藥食同源作物，具有增強性功能[3－4]、抗疲勞、抗氧化[5]、提高生育力[6]、減緩更年期綜合癥[7]等作用?，F(xiàn)已研究表明，云南產(chǎn)不同色型，不同產(chǎn)地的瑪咖在營養(yǎng)物質及生理功能上存在差異，如，云南黑、紫、黃、綠瑪咖中多糖含量為紫色（7.02%）＞黑色（6.93%）＞綠色（6.75%）＞黃色（6.53%）[8]；生物堿含量依次為紫色（4.4078mg/g）、白色（2.919 3 mg/g）、黃色（2.224 1 mg/g），差異達到極顯著水平（P＜0.01）[9]；張毅[10]研究表明，云南紫、黃、白瑪咖對小鼠抗疲勞、非特異性免疫功能、降血脂、缺氧耐受力及抗氧化方面的效果差異，結果表明紫色瑪咖效果最好，白色瑪咖效果較差。

腸道健康與人體健康關系密切，現(xiàn)已有大量研究表明腸道菌群與免疫類疾病、胃腸道疾病、糖尿病等存在關聯(lián)。另外，腸道是口服藥物在體內代謝的重要場所[11]，而瑪咖作為一種新的藥食同源植物[12]，其對腸道健康影響的研究卻非常少。因此研究瑪咖對腸道微環(huán)境和腸道菌群的影響顯得十分必要。本文以云南產(chǎn)不同色型瑪咖對SD雌性大鼠腸道微環(huán)境和腸道菌群的影響，為瑪咖的開發(fā)與應用提供科學的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑪咖：云南省剛捷生物科技有限公司購買；SD雌性大鼠，體質量150 g～160 g，40只：重慶騰鑫生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（渝）20120008；基礎飼料：重慶騰鑫生物技術有限公司提供；戊酸、異戊酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸（色譜純）：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；巴豆酸（色譜純）：日本東京天成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設備

Light Cycler Nano熒光定量PCR儀：美國羅氏公司；GC－2010高效氣相色譜儀、UV－2450紫外分光光度計：日本島津公司；H1MG酶標儀：美國基因有限公司；3－18k冷凍離心機：德國SIGMA公司；S1000梯度PCR儀：美國BIO－RAD公司；Nano Drop 2000微量紫外分光光度：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗樣品的制備與劑量確定

瑪咖作為一種可食用植物，其成人每日推薦攝入量為25 g，中國人平均體質量為60 kg，即成人每日用瑪咖劑量為0.42 g/（kg·bw）[13－15]。

將瑪咖切片后于50℃烘干至恒重，經(jīng)中藥粉碎機粉碎后過150目篩。取瑪咖干粉6 g溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液并定容至50 mL，即得0.12 g/mL濃度樣品懸浮液，4℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.3.2 動物分組和飼養(yǎng)

將40只SD雌性大鼠按體質量隨機分為空白對照組，黑瑪咖，紫瑪咖、黃瑪咖、白瑪咖，各組8只。每只大鼠獨立飼養(yǎng)于（25 cm×15 cm×15 cm）不銹鋼籠里中，動物房溫度控制在（25±1）℃，相對濕度55%，晝夜循環(huán)周期12 h，實驗組每日灌胃0.42 g/（kg·bw）的1%羧甲基纖維素鈉瑪咖干粉（150目）懸浮液，空白組灌胃等體積1%羧甲基纖維素鈉溶液，飼養(yǎng)期間自由采食基礎飼料和飲水飼養(yǎng)，每天記錄一次大鼠采食量，每3 d稱量一次大鼠體質量，同時調整灌胃量，喂養(yǎng)28 d，禁食12 h后稱重。乙醚麻醉后斷頭處死，解剖。取出盲腸組織，稱重后，縱向剖開，取100 g盲腸內容物于1.5 mL無RNA酶離心管中，保存于－80℃用于盲腸內容物中菌群的測定，收集剩余的盲腸內容物保存于－20℃冰箱，備用。用4℃生理鹽水清洗盲腸壁，吸水紙吸干，稱重后并計算其表面積。

1.3.3 飼料效率的測定

1.3.4 盲腸壁面積測定

參考葉敏等[17]方法進行盲腸壁面積的測定，用4℃生理鹽水將盲腸壁洗凈后，在劃有標準刻度的坐標紙上充分展開后，鉛筆勾畫出其輪廓，待坐標紙干燥后復印于打印紙上，剪下輪廓圖，電子天平精密稱量輪廓紙的質量A1（g），以及1cm2打印紙的質量A0（g/cm2），并按以下公式計算。

1.3.5 pH 值測定

稱取一定質量的盲腸內容物于10 mL去離子水預處理離心管中，加入質量與體積為1∶10去離子水，旋渦1min，靜置2min，測上清液pH值。

1.3.6 短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）的測定

準確稱取0.2 g盲腸內容物另入10 mL離心管中，另入2 mL含有5 mmol/L巴豆酸的10 mmol/L氫氧化鈉溶液，4℃，4 000 r/min離心15min，吸取上清液于5 mL離心管中；4℃，10 000 r/min離心15min，吸取上清液 1 mL，過濾（0.25 μm）至 2 mL 進樣小瓶中待測[4]。

氣相色譜條件：柱流量 0.95mL/min，進樣量 1μL，進樣口溫度220℃，柱溫90℃、平衡時間0.5min，5℃/min升溫至150℃，保留時間7min；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min，檢測器溫度 230℃[5]。

1.3.7 游離氨含量測定

將1.3.5預處理的盲腸內容物樣品于4℃，4 000 r/min離心5min，吸取上清液1 mL，依次加入1 mL含有0.001 mol/L Na2Fe（CN）5NO·2H2O 的 0.5 mol/L 苯酚溶液和 1 mL 含有 0.03 mol/L NaClO 的 0.625 mol/L NaOH溶液，60℃保溫5min，625 nm波長下測吸光度[10]。

1.3.8 盲腸內容物微生物的測定

按照糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有效公司）的說明書進行提取。參照文獻[18]設計各腸道菌群聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物，并由華大基因合成，引物序列及擴增片段見表1。反轉錄·聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT－PCR）反應體系為10 μL：SYBR Green Supermix（Bio－Rad 公司）4.2 μL，20 μmol/L上、下游引物各 0.3 μL；焦炭酸二乙酯（oiethy pyrocarbonate，DEPC）水 4.2 μL，100 ng/μL cDNA 模板 1.0 μL。反應條件：95℃預變性30 s；40次循環(huán)包含95℃5 s；60℃30 s；65℃5 s；95℃5 s。計算出各種細菌的Ct值。

表1 各細菌引物序列及產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequences and product lengths of different bacteriabp

1.4 統(tǒng)計分析

實驗結果以mean±SD表示，各組間差異顯著性采用SPSS 16.0軟件分析，各組間比較采用單因素方差分析，用Duncan法分析顯著性，P＜0.05被認為有顯著差異。

2 結果

2.1 瑪咖對實驗大鼠體質量、采食量及飼料效率的影響

瑪咖對實驗大鼠采食量、體質量增加量及飼料效率的影響見表2。

表2 瑪咖對實驗大鼠采食量、體質量增加量及飼料效率的影響（n=8）Table 2 The effects of Maca on feed intake，weight gain and feed efficiency in SD female rats（n=8）

由表2可知，與空白對照組相比，黑瑪咖，紫瑪咖，黃瑪咖和白瑪咖均可增加實驗大鼠體質量，其中黑瑪咖，紫瑪咖和黃瑪咖對實驗大鼠體質量的增加量影響顯著（P＜0.05），體質量增加大小排序分別為：黑瑪咖＞紫瑪咖＞黃瑪咖＞白瑪咖；不同組別瑪咖均有降低實驗大鼠采食量的趨勢，其中黑瑪咖和紫瑪咖可顯著（P＜0.05）降低實驗大鼠采食量。不同組別瑪咖均可提高實驗大鼠飼料效率，其中黑瑪咖，紫瑪咖和黃瑪咖可顯著（P＜0.05）提高實驗大鼠飼料效率。

2.2 瑪咖對實驗大鼠盲腸及其微環(huán)境的影響

瑪咖對實驗大鼠盲腸及其微環(huán)境的影響見表3。

由表3可知，與空白對照組相比，各實驗組均有降低實驗大鼠肓腸總質量的趨勢，其中黑瑪咖和紫瑪咖降低效果顯著（P＜0.05）；黑瑪咖，紫瑪咖和黃瑪咖顯著（P＜0.05）增加實驗大鼠肓腸壁質量，白瑪咖也有增加實驗大鼠肓腸壁質量的作用，但不顯著（P＞0.05）；各實驗組均有增加實驗大鼠盲腸壁表面積的趨勢，其中澤黑瑪咖和紫瑪咖可顯著（P＜0.05）增加實驗大鼠盲腸壁面積。與空白對照組相比，各實驗組均有降低實驗大鼠盲腸內容物pH值和游離氨的作用，其中澤黑瑪咖和紫瑪咖可顯著（P＜0.05）降低實驗大鼠盲腸內容物pH值和游離氨含量；各實驗組均有升高實驗大鼠盲腸內容物含水量的趨勢，但未達到統(tǒng)計學意義。

表3 瑪咖對實驗大鼠盲腸及其微環(huán)境的影響（n=8）Table 3 The effects of Maca on cecum and its microenvironment in SD female rats（n=8）

2.3 瑪咖對實驗大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸的影響

瑪咖對實驗大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸的影響見表4。

表4 瑪咖對實驗大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸的影響（n=8）Table 4 The effects of Maca on short chain fatty acids of cecal contents in SD female rats（n=8）μmol/g

由表4可知，與空白對照組相比，各實驗組均可顯著（P＜0.05）升高實驗大鼠盲腸內容物中乙酸的含量，分別升高了 40.30%、27.77%、21.76%和 22.61%；有升高實驗大鼠盲腸內容物中丙酸和丁酸含量的趨勢，其中黑瑪咖、紫瑪咖和黃瑪咖可著升高（P＜0.05），其中丙酸的含量分別升高了 19.88%、12.09%、9.44%和3.07%，丁酸的含量分別升高了 20.14%、17.26%、9.83%和1.19%；而各實驗組對戊酸、異丁酸和異戊酸含量的影響有降低的趨勢，其中黑瑪咖對異戊酸含量有顯著（P＜0.05）降低，其它各組均不顯著（P＞0.05）；各實驗組均可升高實驗大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸（short－chain fatty acids，SCFA）的含量，其中黑瑪咖和紫瑪咖對實驗大鼠盲腸內容物中SCFA含量影響顯著（P＜0.05），各實驗組 SCFA 含量分別升高了 16.30%、11.24%、7.90%和 6.75%；各實驗組均有降低實驗大鼠盲腸內容物中支鏈脂肪酸（branched chain fatty acid，BCFA）含量的趨勢，但不顯著（P＞0.05）。

2.4 瑪咖對實驗大鼠盲腸內容物中微生物的影響

瑪咖對實驗大鼠盲腸內容物中微生物的影響見表5。

表5 瑪咖對實驗大鼠盲腸內容物中微生物的影響（n=8）Table 5 The effects of Maca on microorganisms of cecal contents in SD female rats（n=8）log10 copies/g

由表5可知，與空白對照組相比，各實驗組腸球菌數(shù)量降低，其中黑瑪咖、紫瑪咖和黃瑪咖降低量顯著（P＜0.05），而白瑪咖對腸桿菌同樣有降低趨勢的影響，但不顯著（P＞0.05）；各實驗組有升高乳酸桿菌和擬桿菌數(shù)量的趨勢，但不顯著（P＞0.05）；各實驗組均有升高實驗大鼠盲腸內容物中雙歧桿菌和梭菌數(shù)量的趨勢，其中黑瑪咖和紫瑪咖影響顯著（P＜0.05）。

3 討論

本實驗的主要目的是探討云南產(chǎn)不同色型瑪咖對SD雌性大鼠腸道健康的影響。在機體運動量與基礎代謝量一致的條件下，大鼠體質量、采食量和飼料效率可間接反映食物在胃腸道內消化吸收情況，灌胃瑪咖后，大鼠的體質量和飼料效率增加，而采食量卻有降低，說明瑪咖能夠促進飼料的消化利用率，可能與瑪咖中的膳食纖維含量有關，瑪咖是公認的優(yōu)質膳食纖維和蛋白質原料來源，研究表明，云南產(chǎn)黑瑪咖和黃瑪咖中膳食纖維含量達37.41%和33.46%，而粗蛋白質含量分別為14.74%和 12.48%[19－20]。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）的組成和總量可以間接反應機體腸道內厭氧菌的數(shù)量和代謝情況，SCFA是由腸道菌群利用宿主不易消化的糖類、蛋白或內源性底物等酵解而產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物[21]，可促進盲腸壁生長，表面積擴大，質量上升?，斂е泻胸S富的淀粉、多糖等碳水化合物，為腸道菌群提供了良好的原料基礎。實驗結果表明，瑪咖可降低實驗大鼠肓腸總質量，有增加肓腸壁質量和表面積的趨勢，其中黑瑪咖和紫瑪咖作用效果顯著（P＜0.05）。糞便含水率增加可增加有毒物質及代謝產(chǎn)物的及時排出體外，減少其在腸道中的停滯時間，維持腸道健康有著重要的作用[22]。研究表明，腸道中雙歧桿菌下降，大腸桿菌和梭菌大量繁殖，合造尿總堿合成受阻，產(chǎn)生更多的氨[23]。與空白對照組相比，各實驗組均有降低實驗大鼠盲腸內容物pH值和游離氨的作用，其中黑瑪咖作用顯著（P＜0.05）；各實驗組均有升高實驗大鼠盲腸內容物含水量的趨勢，但未達到統(tǒng)計學意義。

SCFA主要包括乙酸、丙酸、丁酸等6個及以下碳原子組成的有機酸，其中乙酸、丙酸和丁酸，約占SCFA總量的90%～95%[24]。SCFA不僅是腸道上皮細胞的主要能量物質，還具有調節(jié)機體免疫，減少促炎因子的生成，修復粘膜炎癥，改善腸道功能、調節(jié)腸道菌群平衡等多種作用。而人體腸道細菌發(fā)酵產(chǎn)生SCFA的能力又受腸道菌數(shù)量、pH值及底物的影響[25－26]。實驗結果表明，瑪咖干粉均能增加小鼠肓腸內容物中SCFA的含量，對腸道起一定的保護作用，其中黑瑪咖和紫瑪咖對實驗大鼠肓腸內容物中SCFA的影響顯著（P＜0.05）大于黃瑪咖和白瑪咖。

雙歧桿菌作為腸道中重要的生理菌群，能大量合成動物所需的營養(yǎng)物質和維生總堿，對多種腸道病原微生物產(chǎn)生拮抗，增強機體免疫力，調節(jié)腸道菌群，抗腫瘤，抗衰老等功能[27－28]。黑瑪咖和紫瑪咖能顯著促進盲腸中雙歧桿菌的生長，而抑制腸球菌的生長；各實驗組有升高乳酸桿菌和擬桿菌數(shù)量的趨勢。說明黑瑪咖和紫瑪咖能促進腸道有益菌的生長，抑制腸道有害菌的生長

4 結論

本次實驗結果表明，食用瑪咖對機體腸道健康是有益的，其中黑瑪咖和紫瑪咖對腸道健康的影響效果顯著高于黃瑪咖和白瑪咖。但瑪咖粉碎粒度、營養(yǎng)成分、產(chǎn)地及其食用時間對腸道健康的影響及其機理有待深入研究。

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