徐明喆，孔 銘，李松林，張慶文，王國才，劉麗芳1

(1.中國藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2. 中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室(澳門大學(xué))，澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，澳門；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 中藥質(zhì)量研究室，江蘇 南京210028；4. 江蘇省中醫(yī)藥研究院 中藥代謝組研究室，江蘇 南京210028；5. 暨南大學(xué) 藥學(xué)院 中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州510632)

鵝不食草為菊科植物鵝不食草[Centipedaminima(L.) A.Br. Et Aschers.]的干燥全草，收載于中國藥典2015版一部，性辛、溫，歸肺經(jīng)，具有發(fā)散風(fēng)寒，通鼻竅，止咳的功效[1]，用于治療急慢性鼻炎、過敏性鼻炎、頭痛、百日咳、慢性氣管炎、結(jié)膜炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、瘧疾、濕瘡腫毒、跌打腫痛等[2]。鵝不食草還是許多中成藥如中華跌打丸、芩芷鼻炎糖漿、克痢痧膠囊、辛夷通鼻丸、通關(guān)散和鼻炎康片的主要原料[1]。建立整體質(zhì)量評價方法對全面控制鵝不食草質(zhì)量，保障其飲片和相關(guān)制劑的安全有效具有重要意義。

中國藥典2015版采用顯微鑒別及薄層鑒別對其進(jìn)行質(zhì)量控制；也有研究對鵝不食草中的短葉老鸛草素、總黃酮和總有機(jī)酸等進(jìn)行含量測定[3-5]，但專屬性不強(qiáng)，難以從整體上客觀評價其質(zhì)量。高效液相指紋圖譜技術(shù)專屬性強(qiáng)，信息量大，可以綜合反映藥材的主要成分及其相對含量，是當(dāng)前常用的全面評價藥材質(zhì)量的技術(shù)方法。但是，中藥中含有許多無紫外吸收或紫外吸收較弱的成分，在指紋圖譜中難以體現(xiàn)[6]；現(xiàn)有指紋圖譜技術(shù)也不能全面提供指紋所對應(yīng)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)信息。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不但靈敏度高，專屬性強(qiáng)，而且多能在線提供色譜峰所對應(yīng)的成分結(jié)構(gòu)信息，被廣泛應(yīng)用于中藥定性、定量研究中[7]。目前尚未見到鵝不食草HPLC指紋圖譜相關(guān)報道，Chi-on Chan[8]等曾采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對鵝不食草進(jìn)行定性，但提供的成分信息相對較少。本研究擬建立鵝不食草藥材的HPLC指紋圖譜，并采用UPLC-QTOF-MS法對鵝不食草進(jìn)行系統(tǒng)成分表征，為該藥材的整體質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(Alliance2695四元泵及自動進(jìn)樣系統(tǒng)，2996二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站)(美國Waters公司)；Waters SYNAPT G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Waters ACQUITY UPLCTM液相色譜儀(美國Waters公司)；AT201十萬分之一(瑞士梅特勒公司)；KQ-500D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milipore純化水系統(tǒng)(美國Milipore)。

1.2 材料

12批鵝不食草樣品購自不同地區(qū)，來源見表1，經(jīng)作者鑒定，江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林研究員核實為菊科植物鵝不食草[Centipedaminima(L.) A.Br. et Aschers.]的干燥全草；甲醇(色譜純，江蘇漢邦)；乙腈(色譜純，TEDIA)；乙腈(德國Merk公司)；磷酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(美國ROE Scientific INC公司)；水為超純水；蘆丁、綠原酸、齊墩果酸購于中國藥品生物制品檢定所；槲皮素購于四川維克奇生物科技有限公司。

表1 12批鵝不食草樣品來源及相似度

2 方法

2.1 指紋圖譜色譜條件

AlltimaTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%～15% A，20～60 min，15%～27% A)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長290 nm。

2.2 超高效液相色譜條件

Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(0～2 min，15% A；2～10 min，15%～95% A；10～12 min，95% A)；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正、負(fù)離子掃描模式；Q-TOF采集率0.3 s；低電壓6 V；高電壓30～60 eV；毛細(xì)管電壓2 500 V，錐孔電壓50 V；離子源溫度100 ℃；去溶劑化溫度450 ℃；流速800 L/h；錐孔氣流速50 L/h；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500 Da。采用亮氨酸-腦啡肽(Leucine-enkephaLin，ESI-：m/z554.261 5，ESI+：m/z556.277 1)溶液為校正液。

2.4 指紋圖譜供試品溶液的制備

取鵝不食草粉末約1.0 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，超聲1 h，放冷，再次稱重，用50%甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用供試品溶液的制備

取鵝不食草粉末約1.0 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲1 h，放冷，再次稱重，用甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用甲醇稀釋，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.6 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、齊墩果酸、蘆丁、槲皮素對照品適量，分別配成2.50 μg/mL的甲醇溶液。

3 結(jié)果及討論

3.1 指紋圖譜液相條件考察

為提高鵝不食草中各成分的分離度，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等多種流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相的色譜圖基線較為平穩(wěn)，分離度較好，峰形尖銳。因此，本實驗選擇乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相并對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。采用二極管陣列檢測器在190～400 nm進(jìn)行全波長掃描，考察不同吸收波長下的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)290 nm處各成分均有較高的響應(yīng)值且基線平穩(wěn)，因此選擇290 nm作為檢測波長。

3.2 指紋圖譜樣品制備條件考察

考察不同提取方法(超聲法、回流法)對提取效率的影響，結(jié)果表明，回流法雖所得色譜峰數(shù)目較多，但其重復(fù)性較差(相對峰面積RSD高達(dá)96%)，推測可能在高溫回流過程中發(fā)生了成分轉(zhuǎn)化。為提高方法的重復(fù)性，本實驗采用低溫超聲的方法，重復(fù)性試驗中各主要共有峰的相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于3.0%，符合指紋圖譜要求。同時考察了提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇)、提取時間(30 min、1 h、1.5 h)、提取溶劑量(10 mL、15 mL、20 mL)對提取效率的影響，結(jié)果表明，用20 mL 50%甲醇溶液提取1 h，即能提取完全，符合指紋圖譜分析要求。

3.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗

取鵝不食草樣品(JSPACM-53-1)，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以10號峰為參照峰，各主要共有峰的相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于1.5%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

3.3.2 重復(fù)性試驗

取同一批鵝不食草樣品(JSPACM-53-1)6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以10號峰為參照峰，各主要共有峰的相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗

取鵝不食草樣品(JSPACM-53-1)，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h進(jìn)樣，以10號峰為參照峰，各主要共有峰的相對保留時間RSD均小于0.2%，相對峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜要求。

3.4 指紋圖譜建立

分別取12批鵝不食草樣品按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，得到12批不同產(chǎn)地的鵝不食草藥材的HPLC指紋圖譜。將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004 A版)，以批號為JSPACM-53-1的鵝不食草藥材作為參照圖譜，以中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，設(shè)定時間窗寬度為1.0 min，提取鵝不食草藥材的共有模式建立對照指紋圖譜，共標(biāo)定13個共有峰，結(jié)果見圖1。各共有峰的相對保留時間與相對峰面積見表2、表3。

圖1 鵝不食草藥材指紋圖譜

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S1210.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.2520.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.3230.460.470.470.470.470.470.470.470.470.470.470.4740.510.520.510.520.510.510.510.510.520.520.520.5250.560.560.560.560.560.560.560.560.560.560.560.5660.390.610.610.610.610.610.610.610.610.610.610.6170.750.750.750.750.750.750.750.750.750.750.750.7580.840.840.840.840.840.840.840.840.840.840.840.8490.940.940.940.940.940.940.940.940.940.940.940.94101.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.00111.041.041.041.041.041.041.041.031.041.041.041.04121.061.061.061.061.061.061.061.061.061.061.061.06131.101.101.101.101.101.101.101.101.101.101.101.10

表3 12批鵝不食草共有峰相對峰面積

續(xù)表3

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S1260.080.050.060.040.110.060.070.110.080.080.050.0670.030.030.020.020.080.040.060.060.040.040.040.0480.060.080.060.100.080.120.130.110.040.040.040.1090.070.080.070.060.140.080.050.100.050.070.040.12101.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.00110.010.090.070.060.040.030.090.020.090.080.140.15120.050.160.110.070.240.330.160.150.070.110.090.21130.220.180.200.240.470.340.270.390.120.170.090.27

3.5 相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”對12批鵝不食草藥材進(jìn)行相似度評價，結(jié)果見表1。12批樣品的相似度在0.837～0.997之間。

實驗結(jié)果顯示，不同批次的鵝不食草樣品具有較好的相似性，其共有峰數(shù)目及相對保留時間較為一致，而相對峰面積差異較大，表明其所含化學(xué)成分種類基本一致而含量各不相同，可能是受生長環(huán)境、采收時間、生長年限等因素的影響。

3.6 化學(xué)成分表征

鵝不食草樣品及對照品對應(yīng)基峰強(qiáng)度總離子流圖(BPI圖)見圖2。依據(jù)化合物的精確分子量，碎片離子，結(jié)合對照品標(biāo)準(zhǔn)圖譜及文獻(xiàn)報道，共鑒定了26個化學(xué)成分，包括倍半萜類9個、有機(jī)酸類3個、黃酮及其苷類5個、二萜苷類7個、甾體皂苷類1個、三萜類1個，結(jié)果見表4、表5。

圖2 Dulcoside A的質(zhì)譜裂解特征

峰號tR/min分子式質(zhì)荷比(m/z)測量值理論值誤差(ppm)化合物碎片文獻(xiàn)24.04C27H30O16611.1612611.16120.0蘆丁*649.1117,633.1422,465.1021,303.0501[8]44.39C27H30O15595.1658595.1663-0.8Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyr-anosyl-(1-6)-O-β-glucopyrano-side/Kaempferol-3-O-rutinoside633.1164,617.1470,449.1062,287.0551[8][9]74.61C25H24O12517.1323517.1346-4.4Isochlorogenic acid A/Isochlorogenic acid B/Isochlorogenic acid C555.0874,539.1163,499.1246[8]84.75C25H24O12517.1306517.1346-7.7Isochlorogenic acid A/Isochlorogenic acid B/Isochlorogenic acid C555.0899,539.1155,499.1237[8]145.78C15H10O7303.0501303.0505-1.3槲皮素*285.1846[10]156.00C16H12O7317.0662317.06610.33—甲氧基槲皮素—[8]166.09C19H26O6351.1803351.1808-1.44β,15β-dihydroxy-2α-isobutyrylo-xy-guaia-10(14),11(13)-dien-8β,12-olide373.1623,263.1284,245.1169,227.1066[12]176.81C17H14O7331.0814331.0818-1.2槲皮素-3,3’-二甲酯—[11]187.06C19H26O5335.1857335.1858-0.3Minimolides F357.1668,247.1326,229.1225[13]197.57C20H26O5347.1852347.1858-1.7當(dāng)歸酸堆心菊靈內(nèi)酯/Minimolides E369.1652,247.1334,229.1218[11][13]207.77C19H24O5333.1678333.1702-7.2山金車內(nèi)酯D687.3140,371.1253,355.1524,247.1333,229.1222,201.1272,173.0961[8]217.95C19H26O5335.1843335.1858-4.5山金車內(nèi)酯C691.3457,373.1415,357.1675,247.1336,229.1223,201.1273,173.0961[8]228.18C20H26O5347.1881347.18586.6短葉老鸛草素/Minimolides E/當(dāng)歸酸堆心菊靈內(nèi)酯715.3455,385.1413,369.1679,247.1332,229.1214,201.1270,173.0957[8][11][13]238.35C20H26O5347.1848347.1858-2.9短葉老鸛草素/Minimolides E/當(dāng)歸酸堆心菊靈內(nèi)酯715.3466,385.1407,369.1678,247.1335,229.1223,201.1275,173.0959[8][11][13]248.47C20H26O5347.1848347.1858-2.9短葉老鸛草素/Minimolides E/當(dāng)歸酸堆心菊靈內(nèi)酯715.3466,385.1407,369.1678,247.1335,229.1223,201.1275,173.0959[8][11][13]258.53C20H28O5349.2010349.2015-1.4Minimolides D/異丁酸堆心菊靈內(nèi)酯719.3774,387.1579,371.1835,247.1335,229.1222,201.1274,173.0962[11]

表5 鵝不食草藥材負(fù)離子模式下化合物歸屬

3.6.1 二萜苷類化合物

二萜苷類化合物只在負(fù)離子模式下有響應(yīng)，可見[M-H+HCOOH]-、[M+Cl]-、[M-H]-。如3號峰(tR4.10 min)的低能量可見m/z833.3806[M-H+HCOOH]-、m/z823.3510[M+Cl]-和m/z787.3743[M-H]-，確定化合物相對分子量為788。高能量m/z787.3743[M-H]-失去葡萄糖基，產(chǎn)生

m/z625.3190[M-H-(Glc-H2O)]-，進(jìn)一步失去鼠李糖基，產(chǎn)生m/z479.2646[M-H-(Glc-H2O)-(Rha-H2O)]-，再失去葡萄糖基產(chǎn)生m/z317.2112[M-H-(Glc-H2O)-(Rha-H2O)-(Glc-H2O)]-。將各峰得到的碎片與文獻(xiàn)報道比對[14]，推測3號峰為Dulcoside A or isomers，其裂解方式見圖3。

1.綠原酸 2.蘆丁 14.槲皮素 26.齊墩果酸

3.6.2 黃酮類化合物

黃酮及黃酮苷類化合物在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，正離子模式下可見[M+K]+、[M+Na]+、[M+H]+，負(fù)離子模式下可見[M-H]-。如2號峰(tR4.04 min)的低能量分別給出m/z649.1117[M+K]+、m/z633.1422[M+Na]+、m/z611.1612[M+H]+、m/z609.1454[M-H]-，確定化合物相對分子質(zhì)量為610。高能量正離子模式m/z611.1612[M+H]+失去鼠李糖基，產(chǎn)生m/z465.1021[M+H-(Rha-H2O)]+，進(jìn)一步失去葡萄糖基，產(chǎn)生m/z303.0501[M+H-(Rha-H2O)-(Glc-H2O)]+；負(fù)離子模式m/z609.1454[M-H]-脫去鼠李糖基及葡萄糖基，產(chǎn)生m/z301.0333[M-H-(Rha-H2O)-(Glc-H2O)]-。與對照品比對，確定2號峰為蘆丁(Rutin)。

3.6.3 酚酸類化合物

酚酸類化合物在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，負(fù)離子模式下響應(yīng)較高，正離子模式下可見[M+K]+、[M+Na]+、[M+H]+，負(fù)離子模式下可見[M-H]-。如7號峰(tR4.61 min)的低能量分別給出m/z555.0874[M+K]+、m/z539.1163[M+Na]+、m/z517.1323[M+H]+和m/z515.1191[M-H]-，確定化合物相對分子質(zhì)量為516。高能量正離子模式m/z517.1323[M+H]+失去一分子H2O，產(chǎn)生m/z499.1246[M+H-H2O]+；負(fù)離子模式m/z515.1191[M-H]-脫去一分子咖啡?；a(chǎn)生m/z353.0873[M-H-C9H6O3]-，再脫去一分子咖啡?；?，產(chǎn)生m/z191.0556[M-H-2C9H6O3]-。將各峰得到的碎片與文獻(xiàn)報道比對[8]，推測7號峰為Isochlorogenic acid A或Isochlorogenic acid B或Isochlorogenic acid C。

3.6.4 倍半萜類化合物

倍半萜類化合物只在正離子模式下有響應(yīng)，可見[2M+Na]+、[M+K]+、[M+Na]+、[M+H]+。如21號峰(tR7.95 min)的低能量給出m/z691.3457[2M+Na]+、m/z373.1415[M+K]+、m/z357.1675[M+Na]+、m/z335.1843[M+H]+，確定化合物相對分子質(zhì)量為334。高能量m/z335.1843[M+H]+失去C6位的支鏈，產(chǎn)生m/z247.1336[M+H-C4H8O2]+，再失去一分子H2O，產(chǎn)生m/z229.1223[M+H-C4H8O2-H2O]+。將各峰得到的碎片與文獻(xiàn)報道比對[8]，推測21號峰為山金車內(nèi)酯C(Arnicolide C)。

文獻(xiàn)曾采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對鵝不食草進(jìn)行定性分析，但只分析了其中12個化學(xué)成分[8]。本研究共鑒定了26個化學(xué)成分，同時Dulcoside A、Kaurane pentanedioic acid derivative及3’,4’-didesulphatedcarboxyatractyloside等二萜苷類化合物系首次報道在鵝不食草藥材中發(fā)現(xiàn)。

鵝不食草藥材正離子模式下化合物歸屬和負(fù)離子模式下化合物歸屬詳見參考文獻(xiàn)[8-18]。

4 結(jié) 論

本研究建立的HPLC指紋圖譜穩(wěn)定、可靠，化學(xué)成分表征信息具有“全息”特征，兩種技術(shù)和研究結(jié)果的整合利用可為鵝不食草藥材整體質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

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