許艷萍，郭孟璧，張慶瀅，陳璇，郭蓉，鄧劍川，郭鴻彥，鄧綱，楊明

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650500)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，大量人為活動(dòng)，如：交通系統(tǒng)、電力系統(tǒng)、工業(yè)廢水、化石燃料燃燒、農(nóng)業(yè)化肥和農(nóng)藥等導(dǎo)致大量的重金屬鉛(Pb)釋放，從而導(dǎo)致土壤遭到嚴(yán)重的Pb污染，進(jìn)而帶來一系列不可逆轉(zhuǎn)的生態(tài)系統(tǒng)破壞、人類健康威脅問題[1]。Pb為一滯留時(shí)間長，不可降解、具很強(qiáng)潛在毒性的環(huán)境污染物，被列為世界土壤最典型的重金屬污染元素之一[2]。目前中國受Pb等污染的耕地面積約2000×104hm2，導(dǎo)致糧食每年減產(chǎn)100×108kg，中國28%稻米重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)，嚴(yán)重威脅著中國的糧食安全[3]。

Pb是植物生長的非必需元素，積累在表土中過量的Pb會(huì)抑制種子萌發(fā)和幼苗的生長[4]，引起植物根部中毒、葉色發(fā)黃且葉片變薄、生育期推遲等現(xiàn)象[5]，進(jìn)而引起部分細(xì)胞壁變形、葉綠體膜消失或斷裂、片層結(jié)構(gòu)模糊不清[6]，以及導(dǎo)致細(xì)胞膜的滲透性、流動(dòng)性、蛋白和脂質(zhì)等成分的改變從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的功能破壞[7]，Pb脅迫持續(xù)最終導(dǎo)致一系列的生理生化過程紊亂，直至植株死亡。因此如何有效地控制和治理土壤重金屬污染已成為土壤修復(fù)和生態(tài)恢復(fù)的重要課題。

大麻(CannabissativaL.)屬大麻科(Cannabaceae)、大麻屬(Cannabis)，是一年生草本植物。工業(yè)大麻是通過遺傳改良，無毒品利用價(jià)值，可以合法化推廣種植的大麻，被公認(rèn)是一種高生物量、生長快，能較好地凈化重金屬污染土壤的可再生植物物種[8-9]。目前，國內(nèi)外對(duì)大麻的研究主要集中在富集能力方面[10-11]，有關(guān)Pb對(duì)工業(yè)大麻的生理生化耐性機(jī)制研究目前少見報(bào)道。因此，本研究通過盆栽試驗(yàn)，以工業(yè)大麻耐Pb品種“云麻2號(hào)”為試驗(yàn)材料，研究不同濃度Pb脅迫下，工業(yè)大麻幼苗的適應(yīng)生理生化指標(biāo)及富集特征，揭示工業(yè)大麻修復(fù)Pb污染土壤的生理生化響應(yīng)機(jī)制，以期為未來工業(yè)大麻生物修復(fù)重金屬Pb提供重要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育的早熟型耐Pb工業(yè)大麻品種“云麻2號(hào)”為研究材料。試驗(yàn)土壤基質(zhì)來源于云南省昆明市官渡區(qū)小哨大田耕作層(0-20cm)的土壤，其基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用盆栽，盆缽直徑50cm，高30cm，每盆裝過篩風(fēng)干土21kg。以分析純Pb(NO3)2為處理劑，設(shè)7個(gè)Pb2+濃度水平：0(CK)、100mg/kg、400mg/kg、800mg/kg、1200mg/kg、1600mg/kg、2000mg/kg，即按每盆21kg土計(jì)，每盆土中Pb(NO3)2的用量分別為0g、3.36g、13.44g、26.88g、40.32g、53.76g、67.20g，試驗(yàn)將重金屬Pb(NO3)2按不同處理濃度的用量與過篩風(fēng)干土充分混勻裝盆，放置靜止絡(luò)合15d后進(jìn)行播種。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)為1盆，共21盆。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料種植

每盆播“云麻2號(hào)”種子50顆，待出苗2對(duì)真葉時(shí)，每盆定苗10株。所有盆都種植于同一自然透光的溫室大棚中，正常水分管理。待苗長至3對(duì)真葉時(shí)，剪取形態(tài)學(xué)一致的植株上相同部位的葉片置于液氮罐中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室用于測定相關(guān)生理生化指標(biāo)，并于相同時(shí)期采樣(根、莖、葉)測定重金屬鉛(Pb)含量，以上所有取樣皆重復(fù)3次。

1.3.2 苗期生物量的測定

將對(duì)應(yīng)處理的植株從土壤中取出，根部則用水洗凈后，用濾紙吸干表面水分，稱鮮重，待自然陰干后，稱干重，即為植株生物量。

1.3.3 生理生化指標(biāo)測定

試驗(yàn)葉片生理生長指標(biāo)測定，分別使用95%乙醇法測量葉綠素含量[12]，采用硫代巴比妥酸法[10]測定丙二醛(MDA)含量[10]，采用磺基水楊酸法[12]測定脯氨酸(Pro)含量[10]，采用紫外吸收法[13]測定CAT活性，采用愈創(chuàng)木酚法[14]測定POD活性，采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[15]測定SOD活性。

1.3.4 植株重金屬Pb含量的測定

植物樣品(根、莖、葉)先在105℃下殺青30min，然后70℃烘箱烘干至恒重，并用電子天平稱取各部分干質(zhì)量，烘干樣品粉碎后備測，用V(HNO3)︰V(HClO4)=5︰1的混合液進(jìn)行微波消解、定容。試驗(yàn)用原子吸收分光光度計(jì)法測定樣品中的Pb含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2007和SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb脅迫對(duì)工業(yè)大麻幼苗生物量的影響

植物生長受抑制和生物量積累的減少是重金屬對(duì)高等植物毒害的普遍規(guī)律。由圖1可知，隨著Pb處理濃度的升高，根、莖、葉的干生物量均較之對(duì)照有所增加，由此說明工業(yè)大麻在Pb處理下皆通過提高生物量以此適應(yīng)脅迫。其中，根的生物量在處理濃度為800mg/kg時(shí)達(dá)峰值，為0.86g，與對(duì)照和其它處理濃度達(dá)顯著差異(P﹤0.05)。處理濃度達(dá)2000mg/kg時(shí)，Pb開始影響根的生長導(dǎo)致生物量略有下降，但與對(duì)照差異不顯著。在2000mg/kg高濃度處理下，莖和葉的干生物量與對(duì)照相比未出現(xiàn)下降現(xiàn)象，莖干物質(zhì)量反而顯著高于對(duì)照；但莖、葉生物量分別在Pb濃度400mg/kg、800mg/kg時(shí)達(dá)最大值。

圖1 不同濃度Pb脅迫下工業(yè)大麻苗期生物量(g/株)

2.2 Pb脅迫對(duì)工業(yè)大麻幼苗光合色素含量的影響

光合色素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，植物中光合色素含量變化一定程度顯示逆境下植物所遭受的危害程度[16]。由表2可知，Pb處理濃度在1600mg/kg以下時(shí)，葉綠素a和葉綠素b與對(duì)照相比差異不顯著；當(dāng)濃度達(dá)2000mg/kg時(shí)，葉綠素a、b含量顯著降低。Pb濃度為0-1200mg/kg時(shí)，類胡蘿卜素含量變化不大，但在濃度為1600mg/kg和2000mg/kg時(shí)顯著降低。葉綠素(a+b)和葉綠素(a/b)在處理濃度為2000mg/kg時(shí)較對(duì)照顯著降低。結(jié)果表明工業(yè)大麻光合色素的合成只在高濃度Pb(2000mg/kg)脅迫下才受到抑制，高濃度會(huì)損害葉綠素的結(jié)構(gòu)，對(duì)植株光合作用產(chǎn)生影響，對(duì)植株產(chǎn)生毒害，影響植物的生長。

表2 Pb對(duì)工業(yè)大麻幼苗光合色素含量的影響

2.3 Pb脅迫對(duì)工業(yè)大麻幼苗丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)含量作為植物膜脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)，可直接反映植物遭受逆境傷害的程度。Pb脅迫對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響見圖2。由圖2可知隨著Pb濃度的增加，MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中濃度0-400mg/kg時(shí)MDA含量緩慢增加；濃度為800mg/kg時(shí)MDA含量激增，達(dá)到最高值，隨后逐漸降低，且顯著高于其它處理。另外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除處理濃度800mg/kg外其它處理的MDA含量與對(duì)照相比皆差異不顯著。

圖2 Pb對(duì)工業(yè)大麻幼苗MDA含量的影響

2.4 Pb脅迫對(duì)工業(yè)大麻幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸(Pro)除了作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以外，具有保護(hù)蛋白質(zhì)、生物膜、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和清除活性氧等功能，在保護(hù)植物細(xì)胞免受重金屬脅迫傷害中起到非常重要的作用[17]。在正常環(huán)境條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量較低，但在逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量會(huì)迅速增加，并且游離脯氨酸積累量與逆境程度、植物的抗逆性有關(guān)。Pb脅迫對(duì)脯氨酸含量(Pro)的影響見圖3。

圖3 Pb處理對(duì)工業(yè)大麻Pro含量的影響

由圖3可知，Pb脅迫誘導(dǎo)Pro含量先上升后降低，且所有處理下Pro含量均顯著高于對(duì)照。隨著脅迫濃度加大，Pro含量變化呈現(xiàn)出在0-800mg/kg時(shí)逐漸升高，且在800mg/kg時(shí)達(dá)到最大值204.35μg/g，比對(duì)照水平高出 66.48%，在Pb濃度為1200mg/kg時(shí)，Pro含量又開始降低，說明此濃度開始Pb對(duì)工業(yè)大麻產(chǎn)生傷害，抑制了Pro的合成，植物體對(duì)Pb的耐性逐漸降低，但外觀形態(tài)無毒害癥狀表現(xiàn)，且在1600-2000mg/kg時(shí)Pro也高于對(duì)照水平，說明工業(yè)大麻有可能通過增加Pro的量來提高其對(duì)逆境的抗性。

2.5 Pb對(duì)工業(yè)大麻幼苗抗氧化酶活性的影響

表3 Pb對(duì)工業(yè)大麻抗氧化酶SOD、CAT、POD活性的影響

2.6 不同濃度的Pb脅迫對(duì)工業(yè)大麻幼苗各部位

Pb積累效應(yīng)

不同濃度的Pb脅迫對(duì)工業(yè)大麻幼苗各部位Pb積累效應(yīng)結(jié)果見圖4。

圖4 工業(yè)大麻苗期各器官對(duì)Pb的吸附量

由圖4可知，不同Pb濃度處理在工業(yè)大麻苗期不同部位的累積量不同，隨Pb濃度的升高，幼苗植株的根、莖、葉對(duì)Pb的吸收量也隨之升高。不同Pb濃度下，根對(duì)Pb的吸收遠(yuǎn)高于莖、葉，葉對(duì)Pb的吸收量在各濃度下均為最低。根是Pb最主要的吸收部位，根在濃度400-800mg/kg時(shí)吸收速度最大，莖在濃度800-1200mg/kg時(shí)吸收速度最大，而葉則在1200-1600mg/kg時(shí)吸收速度最大，同時(shí)莖部在1200mg/kg后，吸收Pb速度一直較大。當(dāng)Pb處理濃度為2000mg/kg時(shí)，在根、莖、葉部位積累的Pb含量為347.06mg/kg、238.78mg/kg、161.57mg/kg，莖、葉的轉(zhuǎn)移系數(shù)分別為0.67和0.46，轉(zhuǎn)移系數(shù)小于1，這說明Pb從植株根部遷移到莖和葉的能力不強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

重金屬對(duì)植物具有強(qiáng)毒性作用，可破壞蛋白質(zhì)活性、導(dǎo)致植物過氧化損傷，抑制根系發(fā)育、葉綠素合成，使植物生長矮小、枯黃等，嚴(yán)重時(shí)可致植物死亡[19]。耐性植物在嚴(yán)重重金屬污染地區(qū)可形成抵抗或適應(yīng)重金屬脅迫的相關(guān)形態(tài)生理特征，主要體現(xiàn)為對(duì)重金屬的高度耐性和富集性，評(píng)價(jià)一種植物是否可作為生物修復(fù)的備選植物，除了其高富集性外，其強(qiáng)耐受性、高生物量也是其重要指標(biāo)。

本文發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻在各個(gè)Pb處理濃度下(包括2000mg/kg)根、莖、葉的干生物量均較之對(duì)照有所增加，由此說明大麻為重金屬Pb耐性品種，同時(shí)也說明大麻通過提高生物量以適應(yīng)Pb脅迫。大麻幼苗根、莖、葉生物量分別在Pb濃度800mg/kg、400mg/kg、800mg/kg時(shí)達(dá)最大值(圖1)，而Pb吸收最大速度分別為400-800mg/kg、800-1200mg/kg、1200-1600mg/kg(圖4)。工業(yè)大麻根首先接受Pb脅迫信號(hào)，富集和吸收Pb后，再增大生物量；而莖、葉則先增大生物量再吸收Pb，在低濃度(400mg/kg)時(shí)根部吸收Pb最活躍，隨之在莖部，而在高濃度時(shí)(1600mg/kg)則為葉部，且莖在高濃度Pb脅迫時(shí)一直存在較大吸收速率。結(jié)合葉片生理生化指標(biāo)可知，葉片的葉綠體含量、MDA、SOD、CAT及POD均在400mg/kg時(shí)與對(duì)照無顯著差異，而至800mg/kg時(shí)，葉片MDA和Pro則達(dá)到最大值，由此說明MDA和Pro含量突然快速增加，預(yù)示Pb從莖向葉片轉(zhuǎn)移速度將增大，同時(shí)也說明在Pb處理濃度小于400mg/kg時(shí)，大麻通過Pro濃度升高而增加細(xì)胞滲透平衡而增加抗逆性[20-21]，其平衡表現(xiàn)為MDA水平穩(wěn)定，即膜系統(tǒng)受傷害不明顯[22-23]。至1200-1600mg/kg時(shí)大麻抗氧化酶SOD、CAT和POD達(dá)最大值，說明大麻在葉片吸收Pb速度最大同時(shí)，其抗氧化能力增加，該研究與煙草(NicotianaL.)[21]和龍須草(PoasphondylodesTrin)[24]重金屬脅迫下的研究結(jié)果類似。

現(xiàn)今，已被證實(shí)的重金屬超富集植物，如東南景天(SedumalfrediiHance)、商陸(Radixphytolaccae)、龍葵(Solanumnigrum)、李氏禾(LeersiahexandraSwart)、蜈蚣草(PterisvittataL.)等[25-28]，存在生物量小，生長慢等缺點(diǎn)，生物修復(fù)效果有限，而其它生物量大，生長快，中、低富集植物，如芥菜(Brassicajuncea)、亞麻(Linumusitatissimum)、玉米(ZeamaysL．)、大麥(HordeumvulgareL．)等[29-30]，則存在Pb進(jìn)入食物鏈的危險(xiǎn)。本試驗(yàn)所用的大麻則有效地解決或者避開以上風(fēng)險(xiǎn)，其雖然對(duì)Pb的轉(zhuǎn)移系數(shù)小于1(本文0.67)，但其具有強(qiáng)耐Pb性(本文發(fā)現(xiàn)可適應(yīng)2000mg/kg以上Pb污染)，不進(jìn)入食物鏈(主要收獲纖維)，生育期短(3-4個(gè)月)，高生物量，干物質(zhì)量可達(dá)40000kg/hm2以上[31]，使其在重金屬修復(fù)方面具有無可比擬的優(yōu)勢，在未來重金屬Pb修復(fù)中具有重要的應(yīng)用推廣價(jià)值。

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