程茹 吳紫潔 張凱 李平 謝體波

摘 要：目的是驗證貴州勤邦食品安全科學技術有限公生產(chǎn)的阿維菌素ELISA檢測試劑盒的檢測效果，采用酶聯(lián)免疫法對雞肉和雞肝樣品中阿維菌素的殘留量進行檢測，并與高效液相色譜-質譜法進行對照。結果顯示，該試劑盒對兩種樣品的最低檢測限分別為0.516μg/L、0.609μg/L，試劑盒板內板間變異系數(shù)均小于10%；對兩種樣品做加標回收試驗，其回收率均在95%～120%之間，變異系數(shù)均小于10%；該方法與儀器檢測方法檢測實際樣品的陰、陽性判斷結果一致。結論為該方法穩(wěn)定、可靠，可滿足食品中阿維菌素殘留快速檢測的需要。

關鍵詞：酶聯(lián)免疫 阿維菌素 檢測 雞肉 試劑盒

阿維菌素類藥物是一種被廣泛使用的農(nóng)用或獸用殺菌、殺蟲、殺螨劑，屬于大環(huán)內脂類抗生素，其作為一種抗寄生蟲藥物而被廣泛應用。劉耀川等人對阿維菌素的組成、化學結構、作用機制、不良反應等基礎性質進行了研究[ 1 ]。作為一種毒性化合物，阿維菌素類藥物在動植物中的危害也逐漸得到重視，當前主要的檢測手段有微生物法、儀器檢測法、免疫分析法等[ 2 - 6 ]。由于儀器分析法的樣本前處理及測定操作繁瑣且費用高，其推廣使用受到限制；而微生物法也存在檢測周期長、檢測精度低等缺陷。酶聯(lián)免疫法可彌補以上兩種方法存在的缺陷，兼具操作便捷、精度高、經(jīng)濟、可批量檢測等優(yōu)點，應用前景廣闊。

本實驗采用酶聯(lián)免疫法對雞肉、雞肝中阿維菌素類藥物的檢測效果進行研究，并對比儀器檢測結果以進一步驗證公司自主研究的阿維菌素ELISA試劑盒的檢測效果，從而為雞肉的快速、精準檢測提供高效的檢測途徑。

1材料及設備

材料：阿維菌素ELISA檢測試劑盒（自主研發(fā)），其中含有：96孔酶標板、標準品6瓶（0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，1mL/瓶）、高濃度標準品（1μg/mL，1mL/瓶）、酶標二抗、抗體工作液、底物A液、底物B液、終止液、20×濃縮洗滌液、2×濃縮復溶液；雞肉、雞肝樣品（市售，購自貴陽小河沃爾瑪超市）；甲醇（分析純）、乙腈（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、sep-pak vac12cc（2g）柱（組織樣本方法-使用）、堿性氧化鋁（100～200目，分析純）、正己烷（分析純）、去離子水。

設備：微孔板酶標儀（450/630nm）、旋轉蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質器、振蕩器、渦旋儀、離心機、天平（感量0.01g）、刻度移液管（10mL）、聚苯乙烯離心管（2mL、50mL）、玻璃試管（10mL）、微量移液器（單道：20～200μL、100～1000μL，多道：250μL）。

2 方法

2.1 溶液配制

配液1：復溶工作液。用去離子水將2×濃縮復溶液按1：1體積比例進行稀釋（1份2×濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本的復溶工作液在4℃環(huán)境中可保存一個月。

配液2：洗滌工作液。用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19的體積比進行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境中可保存一個月。

2.2 樣本前處理

將雞肉、雞肝切碎后用均質器均質，稱取5.0±0.05g均質后的樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入10mL甲醇，渦旋儀渦動1min，再用振蕩器震蕩，以3000r/min的轉速離心10min；移取20μL上清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入復溶工作液，按1：9體積比進行稀釋（20μL樣本+18μL復溶工作液）；取20μL用于分析。

2.3 試驗步驟

①將所有試劑取出回溫，使用前搖勻。

②取出所需數(shù)量的微孔板。

③編號：將樣本和標準品對微孔按序編號，每個樣本和標準品做2個平行，并記錄標準孔和樣本孔所在位置。

④加標準品/樣本和抗體工作液：加標準品/樣本20μL至對應微孔中，然后加抗體工作液80μL/孔，輕輕震蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，置于37℃環(huán)境下避光反應30min。

⑤洗板：揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。

⑥加酶標二抗：加入酶標二抗100μL/孔，輕輕震蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光反應30min，取出后重復洗板步驟。

⑦顯色：加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，輕輕震蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于37℃避光顯色15min。

⑧測定：加入終止液50μL/孔，輕輕震蕩混勻，設定酶標儀在450nm處測定OD值。

2.4 阿維菌素濃度的計算

標準品或樣品百分吸光率等于標準品或樣品吸光度值的平均值除以第一個標準品（0μg/L）吸光度值的平均值，再乘以100%，即百分吸光率（%）=B/B0×100%（B為標準品或樣品溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標準溶液的平均吸光度值）。

將樣品的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品所對應濃度，乘以其對應稀釋倍數(shù)即為樣品中阿維菌素實際濃度。

2.5 試劑盒相關指標檢測方法

分別對試劑盒的靈敏度、準確度、精密度進行試驗，并將靈敏度、精密度和準確度與HPLC檢測的靈敏度、精密度和準確度進行對比。

2.5.1 試劑盒靈敏度測定方法

分別對20份空白雞肉、雞肝樣品進行檢測，計算阿維菌素濃度，以20份品中阿維菌素濃度的平均值（ ）和標準差（S）來表示檢測限（LOD），即：

式中：X為實驗重復測定空白樣品的平均值；n為實驗測定樣品的數(shù)量。

2.5.2 試劑盒精密度測定方法

取10個試劑盒，每盒隨機取1塊酶標板，每塊酶標板中隨機抽取20個微孔，測定4.5μg/L標準溶液的吸光度值，計算變異系數(shù)。

2.5.3 樣品準確度和精密度測定方法

向空白樣品中加入阿維菌素標準品，使雞肉中阿維菌素終濃度為10、20、30μg/L，雞肝中阿維菌素終濃度為15、25、35μg/L，每種樣品、每個濃度均做5個平行，按2.4操作方法進行測定，分別計算板內、板間變異系數(shù)及回收率。

2.6 儀器測定方法

參照國標GB/T 23200.20-2016[ 7 ]。

3 結果分析

3.1 標準曲線的繪制

標準品的濃度為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，分別測得其吸光度值為2.043、1.362、0.997、0.683、0.346、0.055，繪制標準曲線如圖1，可知，標準曲線方程為：Y=-33.49X+55.58，R2=0.998。

3.2 試劑盒靈敏度測定結果

參按照2.4的方法，得到阿維菌素試劑盒檢測雞肉、雞肝樣品的檢測限如表1，可知，該試劑盒對雞肉、雞肝幾種樣品的最低檢測限分別為0.516μg/L、0.609μg/L，遠低于國家標準中雞肉和雞肝產(chǎn)品中0.01μg/mL的最低限量要求。

3.3 試劑盒精密度測定結果

由表2可知，阿維菌素試劑盒的板內、板間變異系數(shù)在5%～8%之間，均小于10%，說明該試劑盒重現(xiàn)性好，性能較為穩(wěn)定。

3.4 試劑盒準確度測定結果

向雞肉、雞肝兩種空白樣品中分別添加不同濃度的阿維菌素，每個濃度各5個平行，同時做空白對照，按2.4操作方法測定。分別計算標準偏差及回收率，從表3可知，4種樣品回收率均在95%～120%之間，變異系數(shù)均小于10%，符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號附件2中試劑盒備案參考證券標準中第4點關于精密度和準確度的規(guī)定，說明該阿維菌素檢測試劑盒精密度良好。

3.5 與儀器對比測定結果

3.5.1 靈敏度比較

隨機抽取市售雞肉和雞肝樣品各5份，分別用ELISA試劑盒和高效液相色譜測定樣品中阿維菌素的殘留量，由表4可知，ELISA試劑盒檢測結果與儀器檢測結果復核率為100%，說明ELISA檢測試劑盒靈敏度較高；檢測的20個樣品中三聚氰胺殘留量均未超標，合格率達到100%，說明相關部門已經(jīng)加大對食品安全監(jiān)管力度，違法現(xiàn)象大大減少，保障了人民食品安全和健康。

3.5.2 準確度和精密度比較

在同等條件下，對空白雞肉樣品做阿維菌素添加量為20μg/L的添加回收試驗（其中，ELISA試劑盒檢測方法中，隨機選取3塊酶標板，每塊板做4個平行），比較ELISA試劑盒和高效液相色譜法回收率和變異系數(shù)。由表5可知，儀器檢測方法的回收率在96.78%～105.38%，平均回收率為99.32%，變異系數(shù)為4.12%；兩次平行試驗，ELISA試劑盒的回收率在97.78%～109.98%之間，平均回收率為102.19%，試劑盒板間變異系數(shù)為3.74%；ELISA法和HPLC法測定結果基本一致，符合度基本達到100%，適用于雞肉中阿維菌素的殘留檢測。

4 結論

本研究采用酶聯(lián)免疫法對雞肉、雞肝中阿維菌素殘留量進行檢測，通過與儀器檢測方法做對照，驗證本公司自主研發(fā)的阿維菌素ELISA檢測試劑盒的檢測效果。結果表明，阿維菌素ELISA檢測試劑盒檢測靈敏度較高，對雞肉、雞肝樣品最低檢測限較低，遠低于國家規(guī)定最高殘留量；與高效液相-質譜檢測法相比，檢測結果一致，且試劑盒檢測用時短（30min）、樣品前處理方法簡單、操作簡單、投入少、耗能低，可滿足對雞肉等樣品中殘留阿維菌素的快速檢測。

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[7] GB 23200.20-2016食品中阿維菌素殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法.

基金項目：2017年貴州省工業(yè)和信息化發(fā)展專項資金計劃（項目名稱：技術中心創(chuàng)新能力建設（2017002））；2016年貴陽市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)科學技術計劃項目（項目名稱：磺胺類、阿維菌素類藥物快速檢測實際開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化）；2016年貴州省技術創(chuàng)新項目（項目名稱：慢抗快速檢測試劑盒產(chǎn)業(yè)化）；2016年貴州省科技廳社會攻關計劃項目（項目編號：黔科合[2016]支撐2908號）、2017年貴州省科技支撐項目（項目編號：黔科合支撐[2017]2034）、貴陽市2016年人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資助項目（項目編號：筑人才辦合同字[2016]第13號）。