曹建波 張如華

摘要：檉柳（Tamarix chinensis Lour.）是耐鹽堿的灌木或小喬木，多散生于河漫灘或在沿海灘涂形成大規(guī)模群體。對由Illumina測序開發(fā)的檉柳微衛(wèi)星標(biāo)記反應(yīng)體系進(jìn)行了正交試驗設(shè)計，確定10 μL SSR-PCR反應(yīng)體系的各反應(yīng)物濃度為Mg2+ 0.8 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶 0.5 U、引物0.5 μmol/L、模板DNA 20 ng。

關(guān)鍵詞：檉柳（Tamarix chinensis Lour.）；基因組微衛(wèi)星；PCR反應(yīng)體系；正交試驗

中圖分類號：S793.5；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）07-0122-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.07.029

Establishment and Optimization of gSSR-PCR Amplification System for

Tamarix chinensis Lour.

CAO Jian-bo，ZHANG Ru-hua

（College of Life Sciences Linyi University，Linyi 276000，Shandong，China）

Abstract： Tamarix chinensis Lour. is a salt-tolerance shrub or small tree，scattered in the riverbed or forming large natural populations in coastal tidal areas. For population genetics study of this species，the orthogonal design was used to determine the PCR amplification system of genomic SSR derived from Illumina sequencing in T. chinensis. The 10 μL reaction system of gSSR is as follows：0.8 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，0.5 U Taq DNA polymerase，0.5 μmol/L primers，and 20 ng DNA.

Key words： Tamarix chinensis Lour.； genomic microsatellites； PCR reaction system； orthogonal design

檉柳（Tamarix chinensis Lour.）為起源于第三紀(jì)的古老植物，耐鹽堿和水濕，為多年生灌木或小喬木；主要分布在中國、朝鮮和日本[1]，另美國于19世紀(jì)中葉作為裝飾植物和防治水土流失植物引種，現(xiàn)已擴(kuò)散至美國西南和墨西哥北部，被認(rèn)為是入侵樹種[2]。檉柳群體主要生長在河岸、沿海灘涂等水濕條件較好的立地，在中國經(jīng)常被用作沿海防護(hù)林。

微衛(wèi)星是廣泛分布在真核生物基因組上的1～6堿基核苷酸的串聯(lián)重復(fù)，由于重復(fù)次數(shù)不同造成個體間的序列長度差異，對其差異測算可以得到包括多樣性指數(shù)在內(nèi)的群體遺傳變異參數(shù)估值。由于是共顯性標(biāo)記（可區(qū)別純合體和雜合體），重復(fù)次數(shù)差別大，多態(tài)性高，被廣泛地用于個體指紋圖譜、親本分析和群體遺傳學(xué)研究[3，4]。基于檉柳屬植物EST序列開發(fā)的SSR標(biāo)記（EST-SSR）的反應(yīng)體系的優(yōu)化已見報道[5]，但專門針對檉柳基因組開發(fā)的核基因組SSR（gSSR）的PCR反應(yīng)體系還沒有建立。本研究基于Illumina測序，對檢測到的SSR序列進(jìn)行了引物設(shè)計，并對設(shè)計的檉柳基因組SSR的反應(yīng)體系進(jìn)行了探索和優(yōu)化，以期為檉柳的群體遺傳多相關(guān)性、基因流和交配系統(tǒng)等研究提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料來自山東省昌邑柳潼灶戶鹽場檉柳天然林，采取植株50株，各單株間隔至少50 m以免采到同家系植株。每株樹采集嫩葉放入帶硅膠的塑料袋，帶回實驗室置于-70 ℃冰箱保存供DNA提取。

1.2 DNA提取

采用高鹽低pH法[6]、改良CTAB高鹽法[7]、CTAB裂解-硅珠吸附法[8]3種DNA提取方法，提取的DNA濃度和純度檢測采用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，以確定最優(yōu)提取方法。

1.3 引物和試劑

試驗所用引物由南京金斯瑞生物公司合成，試驗試劑Taq酶、dNTPs、Mg2+和Buffer購自Takara公司。500 bp Marker購自Fermentas公司。自行設(shè)計試驗引物，正向序列為ATGTGGGGAGGTGGAGTG，反向序列為AATGTATGCAGACAAAAG，重復(fù)單元為（TG）8，目的片段長度131 bp。

1.4 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)程序沿用檉柳EST-SSR的PCR反應(yīng)程序[5]：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，引物退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸1 h；4 ℃保存。采用8%的聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，所用儀器為北京六一儀器廠DYCZ-32型電泳槽，經(jīng)銀染法染色檢測分離結(jié)果。

1.5 正交試驗設(shè)計

對PCR反應(yīng)體系中的DNA模板深度、Mg2+濃度、dNTPs、引物濃度和DNA Taq酶濃度進(jìn)行5因素4水平正交試驗設(shè)計L16（4）5（表1），每種處理統(tǒng)一加10×PCR Buffer 1 μL，反應(yīng)體系為10 μL體系。

1.6 引物退火溫度梯度試驗

根據(jù)PCR正交試驗的結(jié)果，選出最佳反應(yīng)體系。選用2個DNA模板在ABI Veriti96熱循環(huán)儀進(jìn)行引物退火溫度梯度設(shè)計，于55～62 ℃設(shè)置8個溫度梯度，溫度梯度差1 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量

對3種DNA提取方法獲得的檉柳DNA隨機(jī)抽取10個樣本進(jìn)行瓊脂糖膠檢測和紫外分光光度計檢測。結(jié)果表明，CTAB裂解-硅珠吸附法最優(yōu)（圖1），瓊脂糖膠檢測的DNA譜帶整齊，雜質(zhì)較少，濃度相對一致；NV 1 000檢測的10個模板DNA濃度在14.57～51.74 ng/μL，OD260 nm/OD280 nm比值在1.60～1.94，DNA模板分子量大小約為23 kb（表2），說明提取的DNA的純度較高、質(zhì)量較好，可以用于后序的檉柳PCR反應(yīng)。而高鹽低pH法和改良CTAB高鹽法2種方法提取檉柳DNA均不理想，主要表現(xiàn)為譜帶不整齊、雜質(zhì)較多（圖2、圖3），由NV 1 000檢測OD260 nm/OD280 nm的值均在1.00～1.30。

2.2 SSR-PCR正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果表明，基于PCR反應(yīng)體系不同組分的16個組合之間存在較大的差異（圖4），1和16 組合最差，1組合沒有產(chǎn)物條帶，16組合產(chǎn)物極淡幾乎擴(kuò)增不出條帶；其他14種組合PCR產(chǎn)物豐度均較高，但產(chǎn)物質(zhì)量明顯不同，其中4、9、10、13、15組合雜帶多，較凌亂，背景太深；2、3、5、6、7、12、14等組合雜帶較少，主帶較明顯；8、11、14組合主帶清晰，幾乎沒有雜帶，考慮到組合8產(chǎn)物條帶更粗，表明產(chǎn)物豐度更高，故選組合8為最優(yōu)SSR-PCR組合，以用于后期的PCR擴(kuò)增；其PCR各反應(yīng)物濃度為Mg2+ 0.8 mmol/L、DNTP 0.25 mmol/L、Tap DNA聚合酶0.5 U、引物0.5 μmol/L、模板DNA 20 ng。

2.3 退火溫度梯度試驗

退火溫度是影響 PCR 特異性擴(kuò)增的重要因素，退火溫度過低擴(kuò)增的非特異條帶多，溫度過高則可造成目的產(chǎn)物量少?；?個檉柳DNA模板的PCR梯度溫度試驗表明（圖5），檉柳gSSR引物在一定的退火梯度范圍內(nèi)，目的產(chǎn)物都能得以擴(kuò)增，但產(chǎn)物的豐度和特異性存在差異。A、G、H（62、56、55 ℃）3種溫度下PCR條帶不清晰，表明產(chǎn)物濃度較低，其他5種退火溫度擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較好，但都有不同程度的非特異性擴(kuò)增，其中C（60 ℃）下2個檉柳DNA模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都比較清晰，雜帶較弱，等位基因比較容易判讀，考慮到其他引物退火溫度的相對一致性，故選C（60 ℃）為該引物退火溫度。

3 小結(jié)

在16種正交組合中，除第1種和第16種組合不能有效擴(kuò)增產(chǎn)物外，其他處理均能得到較高濃度的PCR產(chǎn)物，表明在本試驗設(shè)計中檉柳微衛(wèi)星擴(kuò)增的大多數(shù)組合可以得到有效擴(kuò)增。但從退火溫度的篩選試驗中可看出，不同的退火溫度又明顯地影響擴(kuò)增產(chǎn)物的豐度，因此不同引物擴(kuò)增時還需要分別進(jìn)行引物退火溫度的確定。組合4、9、10、13、15雜帶較多，這5種組合中有3種組合（4、9、15組合）Mg2+濃度最高（1.2 mmol/L），另2種組合的濃度也較高（10和13組合分別為1.0、0.8 mmol/L），表明反應(yīng)體系中較高的Mg2+濃度能夠增加PCR產(chǎn)物的非特異性擴(kuò)增。適當(dāng)?shù)腗g2+濃度有助于Taq DNA聚合酶的聚合作用，但Mg2+濃度過高也會增加非特異性擴(kuò)增，這在許多研究中得到證實[9-11]。2、5、6、7、8、12、14等7種組合所擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較清晰，基本沒有雜帶，尤其組合5、6、7、8都是DNA模板濃度為10 ng/uL的組合，表明DNA模板濃度對本次設(shè)計的各反應(yīng)底物濃度組合較不敏感，這與李亞慧等[11]對菊花的PCR-SSR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果和邵俊培等[12]對馬尾松EST-SSR PCR的反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果一致。本試驗設(shè)計也只在最低的DNA模板濃度（組合1）和最高的DNA模板濃度（組合16）未能擴(kuò)增出產(chǎn)物，從側(cè)面證明了DNA模板濃度對本試驗設(shè)計的各PCR反應(yīng)底物組合的影響較小。

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