， ，

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830046)

植物遭受環(huán)境脅迫會(huì)影響其生理生化變化，從而影響重要的蛋白和基因的調(diào)控。種子萌發(fā)是棉花生長(zhǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵階段，是衡量棉花抗旱性強(qiáng)弱的重要時(shí)期[1]，轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)傳遞過(guò)程中有重要的調(diào)控功能，使植物能夠響應(yīng)干旱脅迫。了解轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)為深入研究棉花抗旱的調(diào)控通路奠定基礎(chǔ)。前人研究進(jìn)展：轉(zhuǎn)錄因子能與基因的順式作用元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)，在植物信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用[2,10]。已有大量研究表明，在模式植物擬南芥中，轉(zhuǎn)錄因子在萌發(fā)期響應(yīng)各種脅迫,如AtWRKY 6在種子萌發(fā)和早期萌發(fā)階段作為一個(gè)正調(diào)控因子調(diào)控ABA信號(hào)途徑[3]；AtMYB 96轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游基因ABI4的表達(dá)調(diào)節(jié)擬南芥萌發(fā)[4]；過(guò)表達(dá)AtDREB2C可延長(zhǎng)種子萌發(fā)時(shí)間并增加種子中ABA含量[5]；NAC家族轉(zhuǎn)錄因子NTL8在擬南芥中通過(guò)鹽調(diào)控途徑介導(dǎo)GA的合成[6]。在其他經(jīng)濟(jì)作物中，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控干旱代謝途徑也已有大量研究，如玉米中DREB 2 A轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因ZmGOLS2的表達(dá)，使玉米在干旱、高鹽、高溫下有較高的萌發(fā)率和存活率[7]；在小麥48個(gè)干旱誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，證實(shí)TaWRKY1和TaWRKY33啟動(dòng)子區(qū)含有許多非生物脅迫響應(yīng)元件，并用熒光定量表明TaWRKY1在高溫和ABA脅迫下表達(dá)上調(diào)，在低溫下表達(dá)上調(diào)；TaWRKY33參與高溫、低溫、ABA和MeJA脅迫[8]。而在棉花中轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下的表達(dá)調(diào)控途徑鮮見報(bào)道。本研究切入點(diǎn)：由于新疆陸地棉新陸早17號(hào)中響應(yīng)干旱的轉(zhuǎn)錄因子研究較少，調(diào)控途徑未知。本研究選用新疆陸地棉新陸早17號(hào)，探討干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，闡明轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑。擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題：檢測(cè)陸地棉新陸早17號(hào)中NAC、MYB、DREB、WRKY轉(zhuǎn)錄因子在萌發(fā)期不同濃度PEG脅迫下的表達(dá)，以闡明干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響，為調(diào)節(jié)植物耐旱的途徑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用棉花種子為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所瑪納斯實(shí)驗(yàn)站提供的新陸早17號(hào)。PEG-6000為分析純。

1.2 試驗(yàn)處理

棉花種子進(jìn)行表面消毒后，浸泡于蒸餾水中24 h。在直徑10 cm方形培養(yǎng)皿內(nèi)鋪2層濾紙，用不同濃度PEG-6000潤(rùn)濕，以傾斜時(shí)皿底無(wú)溶液為標(biāo)準(zhǔn)。將種子從蒸餾水中取出，剝掉種皮，播種于上述濾紙上，每隔2 d添加1次PEG，以保持種子始終在模擬干旱脅迫狀態(tài)下生長(zhǎng)[9]。以雙蒸水潤(rùn)濕濾紙為空白對(duì)照組；以不同濃度PEG潤(rùn)濕濾紙為PEG處理組。分別在播種后第2天、第4天和第6天測(cè)量棉花根長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，將取得的子葉和胚根，迅速凍于液氮中備用。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

棉花總RNA用Omega公司Plant RNA Kit提取，所提取RNA質(zhì)量通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和定量來(lái)檢測(cè)。采用MLV反轉(zhuǎn)RNA合成cDNA。

1.4 干旱脅迫下萌發(fā)期棉花轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列設(shè)計(jì)上下游引物，以GhEF1α為內(nèi)參。qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1μL,SYBR Green 10μL,上下游引物各0.3μL,ROX校正液 0.1μL,用Rnase-free water補(bǔ)至20μL。反應(yīng)過(guò)程為預(yù)變性94 ℃ 30 s,變性94 ℃ 5 min,退火62 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)時(shí)定量PCR儀型號(hào)為ABI 7500，數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT分析[10]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有圖用Graph Pad Prism 5.0軟件繪制，并用該軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方法為單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG脅迫及ABA處理對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響

如圖1及表1所示，利用不同濃度PEG-6000對(duì)新陸早17號(hào)棉花種子進(jìn)行脅迫，隨PEG濃度增加，根長(zhǎng)先增長(zhǎng)后變短，結(jié)合相同條件下的萌發(fā)率，采用該P(yáng)EG濃度梯度處理棉花種子，并檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在萌發(fā)期的表達(dá)。

表1 不同濃度PEG脅迫下棉花種子的萌發(fā)率

PEG-6000濃度萌發(fā)率(%)第2天第4天第6天ck40851002.52695100523801001036959514.5238090

圖1 不同濃度PEG脅迫下棉花根長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果

2.2 萌發(fā)期棉花轉(zhuǎn)錄因子在胚根中的表達(dá)分析

由圖2～圖4可知，根據(jù)檢測(cè)萌發(fā)期不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在棉花胚根中，脅迫2 d時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)PEG脅迫較少，NAC 5在5%PEG脅迫時(shí)，與空白對(duì)照組相比表達(dá)量顯著上調(diào)；NAC 6在2.5%PEG脅迫時(shí)，與空白對(duì)照組相比，表達(dá)量下調(diào)。至脅迫4 d時(shí)，所選轉(zhuǎn)錄因子在PEG處理組與對(duì)照組相比，表達(dá)量都下調(diào)，且有顯著差異。其中，NAC 1、NAC 3、NAC 4、NAC 6、DREB、MYB、WRKY在所有PEG脅迫條件下與對(duì)照組相比差異顯著，NAC 2在10%PEG脅迫下與對(duì)照組相比有差異，NAC 5在14.5%PEG脅迫下與對(duì)照組相比有差異。至脅迫6 d，NAC 4在14.5%PEG脅迫下與對(duì)照組相比表達(dá)量顯著上調(diào)，WRKY在10%PEG脅迫下與對(duì)照組相比表達(dá)量顯著上調(diào)，NAC 6在2.5%、5%、10%PEG脅迫下與對(duì)照組相比表達(dá)量都顯著下調(diào)。結(jié)果表明，脅迫4 d是轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)PEG脅迫的主要時(shí)期。

注：***表示p<0.001,**表示p<0.01,*表示p<0.05。下同。圖2 棉花轉(zhuǎn)錄因子在脅迫2 d胚根中的表達(dá)

圖3 棉花轉(zhuǎn)錄因子在脅迫4 d胚根中的表達(dá)

圖4 棉花轉(zhuǎn)錄因子在脅迫6 d胚根中的表達(dá)

2.3 萌發(fā)期棉花轉(zhuǎn)錄因子在子葉中的表達(dá)分析

由圖5～圖7可看出，與胚根中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)相比，在子葉中，脅迫2 d時(shí)，NAC 1的表達(dá)在各PEG處理組均顯著低于對(duì)照組，10%PEG脅迫時(shí)，NAC 2與NAC 3與對(duì)照組相比表達(dá)量顯著上調(diào)。至脅迫4 d，NAC 1在5%PEG脅迫時(shí)與對(duì)照組相比表達(dá)了顯著上調(diào)，在2.5%和14.5%PEG脅迫時(shí)，NAC 2和NAC 3與對(duì)照組相比表達(dá)量顯著下調(diào)，NAC 5在所有PEG處理組的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，MYB在2.5%和5%PEG脅迫時(shí)與對(duì)照組相比表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，在14.5%PEG脅迫時(shí)，表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組。至脅迫6 d，NAC 2、NAC 3、NAC 5、NAC 6及DREB在2.5%PEG脅迫下，表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，NAC 4在5%、10%及14.5%PEG脅迫時(shí)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，WRKY在10%和14.5%PEG脅迫時(shí)與對(duì)照組相比表達(dá)量有差異。以上結(jié)果表明，在子葉中，轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)PEG脅迫是分時(shí)段進(jìn)行的，未出現(xiàn)某一時(shí)期集中響應(yīng)PEG脅迫。

3 討 論

植物響應(yīng)干旱脅迫是由許多生理水平及分子水平的改變組成的復(fù)雜過(guò)程。在干旱脅迫下，許多轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)單獨(dú)發(fā)揮作用或者共同調(diào)控形成一個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)[11-12]。植物通過(guò)激活由基因網(wǎng)絡(luò)控制的一系列生理生化反應(yīng)，在分子、細(xì)胞和整個(gè)植物水平上響應(yīng)和適應(yīng)干旱。根據(jù)在干旱脅迫下表達(dá)發(fā)生改變的基因具有的潛在功能，主要分為以下兩類：一類是在信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄控制中發(fā)揮作用的基因，如激素，蛋白激酶，磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子；另一類由保護(hù)植物細(xì)胞抵御外界脅迫的基因組成，有脫水蛋白，熱休克蛋白，衰老相關(guān)基因，膜滲透保護(hù)劑等[13-14]。目前，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到調(diào)控途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，用沉默或過(guò)表達(dá)方式驗(yàn)證其功能。本研究檢測(cè)了新疆陸地棉品種新陸早17號(hào)中GhNAC 1-6、GhMYB、GhDREB、GhWRKY在PEG脅迫下表達(dá)的變化，確定其是否響應(yīng)PEG脅迫，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

圖5 棉花轉(zhuǎn)錄因子在脅迫2 d子葉中的表達(dá)

圖6 棉花轉(zhuǎn)錄因子在脅迫4 d子葉中的表達(dá)

圖7 棉花轉(zhuǎn)錄因子在脅迫6 d子葉中的表達(dá)

通過(guò)比較分析各時(shí)期轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)PEG脅迫集中于脅迫4 d，其中NAC 1、NAC 3、NAC 4、NAC 6、DREB、MYB及WRKY在各PEG脅迫濃度表達(dá)量都顯著或極顯著低于對(duì)照組，該結(jié)果與Meng C等[15]、Zhang X等[16]的結(jié)果部分一致，其中NAC 4與NAC 6響應(yīng)PEG脅迫結(jié)果與Meng C報(bào)道一致，NAC 1與NAC 3響應(yīng)PEG脅迫與Meng C報(bào)道不一致，產(chǎn)生該結(jié)果可能的原因是檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)期不同，本研究在種子萌發(fā)過(guò)程中檢測(cè)基因是否響應(yīng)PEG脅迫，而Meng C在幼苗期及開花后檢測(cè)基因是否響應(yīng)PEG脅迫。此外DREB響應(yīng)PEG脅迫，與Bo H[17]，Ma L F等[18]的結(jié)果一致，WRKY與Yan Y等[19]，Phukan U J等[20]的結(jié)果一致，說(shuō)明在陸地棉不同品種中，該轉(zhuǎn)錄因子可能發(fā)揮相同的作用；MYB響應(yīng)PEG脅迫與Chen T等[21]，Baldoni E等[22]的結(jié)果一致，說(shuō)明不同品系的棉花中，MYB轉(zhuǎn)錄因子具有相同的調(diào)控作用。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子在胚根和子葉中不同時(shí)間的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在胚根中，轉(zhuǎn)錄因子集中在脅迫第4天響應(yīng)PEG脅迫，NAC 2和NAC 5分別在10%、14.5%PEG脅迫與對(duì)照組相比表達(dá)量有差異，其余轉(zhuǎn)錄因子在各PEG脅迫下表達(dá)量都顯著或極顯著低于對(duì)照組，其中NAC 1、NAC 3、NAC 4、NAC 6、DREB、MYB及WRKY分別平均下調(diào)了61.57倍、3.78倍、7.67倍、42.42倍、13.32倍、80.51倍及135.67倍。在子葉中，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與胚根中不同，脅迫時(shí)間不同，有不同的基因響應(yīng)PEG脅迫，如在脅迫第2天，NAC 1在PEG脅迫組表達(dá)顯著低于對(duì)照組，表達(dá)量平均下調(diào)了6.71倍；脅迫第4天，NAC 2、NAC 3、NAC 5與MYB在PEG處理組表達(dá)量分別下調(diào)了3.5倍、3.75倍、7.5倍、1.61倍；脅迫第6天，NAC 4下調(diào)了11.88倍，NAC 6、DREB、WRKY分別上調(diào)了2.83倍、1.75倍、304倍。

4 結(jié) 論

通過(guò)檢測(cè)萌發(fā)期陸地棉品種新陸早17號(hào)中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，結(jié)果表明，所篩選的轉(zhuǎn)錄因子都響應(yīng)PEG脅迫，胚根中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)明顯，尤其是NAC 1、MYB、WRKY分別下調(diào)了61.57倍、80.51倍、135.67倍。

參考文獻(xiàn):

[1]王俊娟,葉武威,王德龍,等.PEG脅迫條件下41份陸地棉種質(zhì)資源萌發(fā)特性研究及其抗旱性綜合評(píng)價(jià)[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2011,12(6):840-846.

[2]Hobert O.Gene regulation by transcription factors and microRNAs[J].Science,2008,319(5 871):1 785-1 786.

[3]Huang Y,Feng C Z,Ye Q,et al.Arabidopsis WRKY 6 Transcription Factor Acts as a Positive Regulator of Abscisic Acid Signaling during Seed Germination and Early Seedling Development[J].Plos Genetics,2016,12(2):e 1005833.

[4]Lee K,Lee H G,Yoon S,et al.The Arabidopsis MYB 96 Transcription Factor Is a Positive Regulator of ABI4 in the Control of Seed Germination.[J].Plant Physiology,2015,168(2):677.

[5]Je J,Chen H,Song C,et al.Arabidopsis DREB 2 C modulates ABA biosynthesis during germination.[J].Biochemical & Biophysical Research Communications,2014,452(1):91-98.

[6]Kim S,Lee A,Yoon H,et al.A membrane-bound NAC transcription factor NTL 8 regulates gibberellic acid-mediated salt signaling in Arabidopsis seed germination.Plant J[J].Plant Journal,2008,55(1):77.

[7]Gu L,Zhang Y,Zhang M,et al.ZmGOLS 2,a target of transcription factor ZmDREB 2 A,offers similar protection against abiotic stress as ZmDREB 2 A[J].Plant Molecular Biology,2016,90(1-2):157.

[8]He G H,Xu J Y,Wang Y X,et al.Drought-responsive WRKY transcription factor genes TaWRKY 1 and TaWRKY 33 from wheat confer drought and/or heat resistance inArabidopsis:[J].Bmc Plant Biology,2016,16(1):116.

[9]常丹,楊藝,王艷,等.24-表油菜素內(nèi)酯對(duì)PEG與鹽脅迫下棉花種子萌發(fā)的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,24(3):96-101.

[10]嚴(yán)曉紅,包秋娟,張富春.干旱脅迫下油菜素內(nèi)酯浸種對(duì)棉花種子萌發(fā)期NAC轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,54(8):1 414-1 421.

[11]Singh D,Laxmi A.Transcriptional regulation of drought response:a tortuous network of transcriptional factors[J].Frontiers in Plant Science,2015,6.

[12]Nakashima K,Yamaguchishinozaki K,Shinozaki K.The transcriptional regulatory network in the drought response and its crosstalk in abiotic stress responses including drought,cold,and heat.[J].Frontiers in Plant Science,2014,5(170):170.

[13]Padmalatha K V,Dhandapani G,Kanakachari M,et al.Genome-wide transcriptomic analysis of cotton under drought stress reveal significant down-regulation of genes and pathways involved in fibre elongation and up-regulation of defense responsive genes[J].Plant Molecular Biology,2012,78(3):223-246.

[14]Chaves M M,Flexas J,Pinheiro C.Photosynthesis under drought and salt stress:regulation mechanisms from whole plant to cell[J].Annals of Botany,2009,103(4):551.

[15]Meng C,Cai C,Zhang T,et al.Characterization of six novel NAC genes and their responses to abiotic stresses inGossypiumhirsutumL.[J].Plant Science,2009,176(3):352-359.

[16]Zhang X,Zhen J,Li Z,et al.Expression Profile of Early Responsive Genes Under Salt Stress in Upland Cotton (GossypiumhirsutumL.)[J].Plant Molecular Biology Reporter,2011,29(3):626-637.

[17]Bo H,Jin L G,Liu J Y.Molecular cloning and functional characterization of a DREB 1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton[J].中國(guó)科學(xué):生命科學(xué),2007,50(1):7.

[18]Ma L F,Zhang J M,Huang G Q,et al.Molecular characterization of cotton C-repeat/dehydration-responsive element binding factor genes that are involved in response to cold stress[J].Molecular Biology Reports,2014,41(7):4 369-4 379.

[19]Yan Y,Jia H,Wang F,et al.Overexpression of GhWRKY 27 a reduces tolerance to drought stress and resistance to Rhizoctonia solani infection in transgenic Nicotiana benthamiana[J].Frontiers in Physiology,2015,6(265):265.

[20]Phukan U J,Jeena G S,Shukla R K.WRKY Transcription Factors:Molecular Regulation and Stress Responses in Plants[J].Frontiers in Plant Science,2016,7(807560):760.

[21]Chen T,Li W,Hu X,et al.A Cotton MYB Transcription Factor,GbMYB 5,is Positively Involved in Plant Adaptive Response to Drought Stress[J].Plant & Cell Physiology,2015,56(5):917.

[22]Baldoni E,Genga A,Cominelli E.Plant MYB Transcription Factors:Their Role in Drought Response Mechanisms[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(7):15 811-15 851.