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(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所， 昆明 650205；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)社會(huì)服務(wù)辦公室, 昆明 650201； 4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 昆明 650201)

油菜是四大主要油料作物之一，在世界油料作物中發(fā)揮著舉足輕重的作用，油菜籽全球總產(chǎn)僅次于大豆[1]，同時(shí)油菜也是植物蛋白質(zhì)飼料來(lái)源[2]。研究表明，作物正反交種子的某些性狀會(huì)產(chǎn)生差異，是由于受母體植株基因型的影響和卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。E.Millet等在研究小麥正反雜交過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其籽粒蛋白質(zhì)的含量受母體效應(yīng)的影響[3]。Singh等認(rèn)為，大豆籽粒蛋白質(zhì)含量具有較強(qiáng)的母體效應(yīng)[4]。Brim等研究發(fā)現(xiàn)，大豆籽粒油分含量也具有較強(qiáng)的母體效應(yīng)[5]。D.G.Dan等在棉花雜交中發(fā)現(xiàn)，種子的含油量存在母體效應(yīng)，而且母體效應(yīng)高于基因遺傳效應(yīng)[6]。目前，關(guān)于油菜種子性狀的遺傳控制研究還較少，僅王新發(fā)[7]對(duì)甘藍(lán)型油菜種子含油量進(jìn)行了研究。為此，本研究選取種子含油量、大小等性狀差異顯著的2個(gè)甘藍(lán)型油菜DH系進(jìn)行正反交，并對(duì)正反交種子進(jìn)行性狀比較分析，旨在探索油菜種子性狀的遺傳控制機(jī)制，為解析其分子機(jī)制提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

親本材料為甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)品系DH 0729和DH 0216，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 材料種植

為了使2個(gè)親本花期相遇，進(jìn)行不同時(shí)期播種，種植在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)地。2016年10月5日播種DH 0729，2016年10月15日播種DH 0216，后期進(jìn)行油菜常規(guī)栽培管理。

1.2.2 人工去雄與授粉

選擇生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲害的植株為試驗(yàn)對(duì)象。父本于授粉前3 d摘除已開(kāi)放的花蕾，并套袋隔離。于授粉前1 d摘除母本主花序上已開(kāi)放花蕾及上部較小的花蕾，保留5～7個(gè)較大的將要開(kāi)放的花蕾進(jìn)行人工去雄，然后套袋隔離，并掛牌標(biāo)記。于次日09：00—11：00時(shí)用棉簽將父本花粉授在母本柱頭上，并立即套袋隔離。以DH 0729為母本，DH 0216為父本配制正交組合，記為DH 29-16。以DH 0216為母本，DH 0729為父本配制反交組合，記為DH 16-29。成熟時(shí)收獲種子，并統(tǒng)計(jì)角果數(shù)。

1.2.3 種子形態(tài)性狀的測(cè)定

種子大小以千粒重、直徑計(jì)量。用千分之一電子分析天平隨機(jī)稱量1 000粒種子的重量，重復(fù)3次。用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量種子直徑，每次測(cè)量50粒種子，重復(fù)3次。在體視顯微鏡下將種皮、子葉、胚剝離開(kāi)，每次50粒種子，然后分別稱量種皮、子葉、胚的重量，重復(fù)3次。

1.2.4 含油量的測(cè)定方法

將除去雜質(zhì)干凈的油菜種子寄到河南大學(xué)河南省植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，用丹麥 Foss 公司NIR 5000型近紅外光譜分析儀測(cè)定種子的含油量和幾種常見(jiàn)脂肪酸的含量及硫甙的含量。

1.2.5 種子不同組織的含油量測(cè)定

分別稱取0.2 g種皮、子葉、胚放入玻璃離心管中，在65 ℃烘箱中處理1周，完全烘干脫水后轉(zhuǎn)入研缽中，加液氮充分研磨成粉末，然后將粉末全部轉(zhuǎn)移至玻璃提油管中，加800μL的正己烷/異丙醇(3∶2)提取液，靜置1 min后在渦旋儀上振蕩混勻10 min，然后3 000 r/min離心8 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一已稱重的提油管中，并再在沉淀中加入500μL正己烷/異丙醇(3∶2)提取液，在渦旋儀上振蕩混勻10 min，3 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清并合并兩上清液，真空干燥，然后稱重，減去管重即獲得油脂重量。每種組織重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜正反交結(jié)角果率的差異

對(duì)油菜正反交的結(jié)角果率進(jìn)行分析，結(jié)果(表1)表明，正反交的結(jié)角果率有一定的差異，正交的結(jié)角果率為85.9%，反交的結(jié)角果率為77.1%，反交的結(jié)角果率要低于正交的結(jié)角率。理論上同一物種不同品種或品系間雜交不會(huì)存在授粉和結(jié)實(shí)的差異，但在本研究中正反交結(jié)角果率表現(xiàn)出差異，可能是由于在人工授粉去雄過(guò)程有一些花蕾的柱頭或子房受到了損傷，使授粉到柱頭上花粉不能很好地萌發(fā)和受精，導(dǎo)致角果發(fā)育不正常而脫落。

表1 正反雜交組合結(jié)角果率

雜交組合授粉花蕾總數(shù)(個(gè))成熟角果數(shù)(個(gè))結(jié)角果率(%)DH29-1652144885.9DH16-2958645277.1

2.2 油菜正反交種子大小的差異

對(duì)親本以及正反交種子千粒重進(jìn)行分析，結(jié)果(圖1)表明，親本千粒重差異顯著，親本DH 0729的千粒重為5.074 0 g，親本DH 0216的千粒重為3.301 1 g。但其正反交種子千粒重差異不明顯，正交種子千粒重為6.060 4 g ，反交種子千粒重為5.998 9 g。對(duì)親本及正反交種子的直徑進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律。2個(gè)親本的種子直徑差異明顯，DH 0729

表2 種皮、子葉、胚占種子的占比(單位：%)

品種種皮子葉胚子葉+胚DH072916.45±0.3707b70.58±0.2316a10.76±0.6463d81.01±0.3356bDH021618.32±0.1708a63.46±1.3639c17.05±0.9027a81.64±1.8887bDH29-1616.69±1.416b68.78±1.6991a11.18±0.8650c82.30±1.7494aDH16-2916.97±0.4809a66.70±0.1301b15.17±0.7267b83.97±0.4915a

表3 種子各種脂肪酸差異分析(單位：%)

品種油酸亞油酸亞麻酸芥酸飽和脂肪酸DH072959.83±0.34b20.84±0.43a8.55±0.44b11.58±0.57a7.24±0.07aDH021663.53±0.79a17.58±1.01b7.64±1.13c11.25±1.38a6.69±0.03bDH29-1660.94±0.69a18.30±0.24a8.73±0.16b11.79±0.10a7.38±0.03aDH16-2957.93±1.76b18.88±1.10a10.02±0.58a11.93±1.39a6.74±0.05b

表4 種子不同組織含油量分析(單位：%)

品種種子含油量種皮子葉胚DH072937.47±0.76b2.87±0.10b33.65±2.68b36.30 ±1.79aDH021646.20±1.16a1.91±0.15c42.40±2.35a37.06±1.32aDH29-1638.11±0.22b2.70±0.17a35.42±1.71b34.75 ±1.72aDH16-2946.66±1.86a2.15±0.15c42.15 ±1.75a36.77±1.44a

種子的平均直徑為2.005 9 mm，屬于大種子，DH 0216種子的平均直徑為1.221 5 mm，屬于小種子。而正反交種子直徑的差異不顯著，正交種子的平均直徑為2.260 1 mm，反交種子的平均直徑為2.136 9 mm。由此可見(jiàn)，不論是正交，還是反交，種子大小并未表現(xiàn)出偏向性，不受母體效應(yīng)(基因型)的影響。正反交種子的大小均大于最大的親本，并且差異顯著，這是由于在進(jìn)行雜交時(shí)每個(gè)花序只保留了5～7朵花，有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)角果和種子發(fā)育之需要。另外，正反交雜種子的成熟期延緩，增加了種子發(fā)育和灌漿的時(shí)間，從而使正反交種子的千粒重和直徑顯著地增加。

2.3 油菜種子不同組織的占比分析

對(duì)油菜種子不同組織的占比進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)表明，在油菜種子中，子葉占比在60%以上，而種皮和胚的占種比較小，均在20%以下。種皮、子葉以及葉+胚的占比在親本和正反交種子中差異都不明顯，而且正反交的也沒(méi)明顯地表現(xiàn)出偏母性。但胚的占比在2親本之間及正反交之間差異顯著，而且表現(xiàn)出明顯的偏母性，母本占比低的其后代的占比也低，母本占比高的其后代得占比也較高，說(shuō)明胚的占比存在母體效應(yīng)。

2.4 種子含油量與脂肪酸組成的差異分析

利用近紅外儀對(duì)親本和正反交種子的含油量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)正反交種子的含油量差異顯著，母本含油量高的，其雜交種子的含油量也高；母本含油量低的，其雜交種子含油量也低，說(shuō)明油菜種子含油量存在明顯母體效應(yīng)，具有偏母性。采用重力法對(duì)種子不同組織的含油量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)種皮的含油量普遍較低,為2%左右，而子葉和胚的含油量較高，均在30%以上，說(shuō)明油脂主要在子葉和胚中累積。此外，正反交種子的種皮、胚的含油量差異不明顯，沒(méi)有呈顯出偏母性，而正反交種子的子葉含油量差異顯著，并呈現(xiàn)出偏母性。這說(shuō)明正反交種子含油量的偏母性是由子葉含油量的偏母性決定的，是由于子葉的含油量比較高，特別是子葉在種子中的占比表現(xiàn)特別高，達(dá)到70%。雖然胚的含油量較高，但由于其在種子中的占比表現(xiàn)特別低，不到20%，因此，不會(huì)影響到種子含油量的偏母性。但在本研究中所測(cè)得的油菜種子不同組織的含油量都低于整個(gè)種子含油量，這主要與測(cè)定方法有關(guān)，因?yàn)樵诮M織含油量的測(cè)定過(guò)程中有一定的油脂損失，如組織粉末轉(zhuǎn)移不完全或油脂抽提不完全等。

圖1 種子千粒重顯著性比較

圖2 種子的直徑顯著性分析

利用近紅外儀測(cè)定了親本和正反交種子幾種主要脂肪酸的含量，發(fā)現(xiàn)油酸、亞麻酸、飽和脂肪酸的含量在親本間存在一定的差異，在正反交種子間同樣也存在一定的差異，但并未呈現(xiàn)出偏母性。而亞油酸含量在親本間存在一定的差異、但在正反交種子間沒(méi)有差異。僅芥酸含量在親本、正反交種子間差異不明顯，這可能與它們均為雙低油菜、其芥酸基因隱性純合有關(guān)。

3 討 論

油菜種子性狀的遺傳機(jī)制研究，有利于遺傳高產(chǎn)育種。本研究發(fā)現(xiàn)，正反交種子千粒重、直徑都顯著大于親本。王杰利在對(duì)甘藍(lán)型營(yíng)養(yǎng)分配研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)分配調(diào)控可以使油菜主花序角果收獲的種子千粒重增加，最高可以增加1倍左右[8]，本研究結(jié)果與之相符。楊光等研究發(fā)現(xiàn)，油菜正反雜交后能導(dǎo)致種子胚的干重略微增加[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，正反雜交子葉和胚總重比均略大于親本，但是胚/種比具有明顯偏母性，而種皮和子葉占比無(wú)明顯的偏母性，而前人未見(jiàn)研究和報(bào)道。同時(shí)對(duì)油菜種子的組分分析發(fā)現(xiàn)，油菜種子大小差別主要來(lái)自于子葉占整個(gè)種子的比，子葉占種比越大種子就越大。

本研究發(fā)現(xiàn)，正反交種子及組分中子葉含油量具有明顯偏母性，而種皮、胚的含油量未表現(xiàn)出偏母性。韋存虛等在對(duì)油菜種子不同組織的油體進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，種子子葉細(xì)胞大部分區(qū)域都被油體所充實(shí)[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，油菜的油脂主要儲(chǔ)存在子葉中。對(duì)種子不同組織的占比和含油量分析發(fā)現(xiàn)，種子中子葉/種比遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胚/種比，雖然子葉和胚在種子中含油量相差不大，但是胚/種比明顯低于子葉/種比，說(shuō)明油菜正反交種子含油量高低主要是其子葉大小和含油率共同決定。但是目前對(duì)于油菜正反交種子含油量偏母性的調(diào)控機(jī)制還不清楚。王通強(qiáng)在對(duì)甘藍(lán)型油菜的雜交后代種子含油量的遺傳做了部分研究，發(fā)現(xiàn)后代種子含油量與母體含油量呈顯著正相關(guān) , 而與父本含油量則無(wú)明顯相關(guān)性[11]。同時(shí)油菜種子含油量屬于多基因控制的數(shù)量性狀，較易受到外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致含油量差異性。作為油料作物，油菜種子在發(fā)育過(guò)程中，物質(zhì)的積累比較復(fù)雜，涉及糖和脂肪累積2個(gè)不同階段，在中間代謝方面會(huì)受到大量調(diào)節(jié)因素的控制，使得含油量遺傳調(diào)控變得極其復(fù)雜[12]，因此對(duì)含油量調(diào)控解析進(jìn)展緩慢，對(duì)于正反交導(dǎo)致含油量的差異和偏母性原因至今沒(méi)有很好的解釋。

種子含油量大小由種子千粒重和含油率構(gòu)成。因此,在以后油菜育種過(guò)程中，可以通過(guò)植株角果合理的營(yíng)養(yǎng)分配提高種子千粒重，在分子水平對(duì)子葉含油率進(jìn)行調(diào)控，最終達(dá)到增加油菜種子產(chǎn)油量的目的，從而培育出超高產(chǎn)油菜新品種。

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