俎 峰，趙凱琴，張云云，原小燕，田正書，賀 斌，奚俊玉，束正齊，符明聯(lián)*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，云南 昆明 650225；2.臨滄市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，云南 臨滄 677000；3.玉龍縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 玉龍 674100)

【研究意義】油菜是中國最重要的食用油料作物，常年播種面積超過700萬hm2，產(chǎn)量1600萬t以上[1]，其產(chǎn)油量年均占國產(chǎn)食用油料作物產(chǎn)油量的50 %以上[2]。在中國日趨緊張的食用油料供給形勢下大力發(fā)展油菜生產(chǎn)對保障我國食用油安全具有重要意義?！队筒肆挤N科技創(chuàng)新規(guī)劃(2016-2020)》指出：“當(dāng)前中國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢是大力提高單產(chǎn)、含油量和改良特殊脂肪酸品質(zhì)”[3]。因此，提高油菜籽含油量是當(dāng)前及今后一段時間內(nèi)油菜新品種選育的重點?！厩叭搜芯窟M展】國內(nèi)眾多育種者通過種質(zhì)創(chuàng)新，已獲得了籽粒含油量在50 %以上，乃至超過60 %的高含油量種質(zhì)材料[4-6]。如何高效的將這些高含油量種質(zhì)材料便捷地應(yīng)用到新品種選育中，是油菜育種者亟需解決的問題。前人研究表明，油菜籽粒含油量主要由母體效應(yīng)、胚基因效應(yīng)、花粉直感、細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)及相應(yīng)的基因與環(huán)境互作效應(yīng)共同控制，符合加性-顯性-上位遺傳模型，并且以加性、顯性遺傳為主，具有較高的廣義遺傳力[7-10]，是典型的數(shù)量遺傳性狀，適合遺傳連鎖作圖與QTL分析。目前，各國研究學(xué)者分別在甘藍(lán)型油菜的 19條連鎖群上鑒定了3到27個含油量的 QTLs[11-14]。Ecke等[11]在甘藍(lán)型油菜 DH 群體的連鎖群 A6、A10 和 C2 上檢測到3個種子含油量相關(guān)的 QTLs，這3個位點的加性效應(yīng)解釋 51 %的表型變異。Qiu等[13]在甘藍(lán)型油菜 TNDH 群體的連鎖群 A1、A3、A4、A8、C2、C3 和 C7 上鑒定了 7 個與種子含油量有關(guān)的 QTLs，共解釋了 55 %的表型變異，其中位于 A1、A8 和 C3 染色體上的 QTLs 與控制芥酸含量的 QTLs一致。Zhang等[14]揭示了在甘藍(lán)型油菜 BC1F1群體的連鎖群 A1，A8，A10 和 C3 上有 5 個與含油量有關(guān)的 QTLs。Chen等[15]在甘藍(lán)型油菜DH群體的連鎖群 LG1～8、LG10、LG12～14、LG16 和 LG18 上,在6個環(huán)境中鑒定了27個與種子含油量有關(guān)的 QTLs。但鮮有在云南生境下利用連鎖作圖群體開展含油量QTL研究的報道?！颈狙芯壳腥朦c】利用云南省農(nóng)科院經(jīng)作所油菜中心自主種質(zhì)創(chuàng)新獲得的含油量超50 %的純系種質(zhì)材料G28及云南甘藍(lán)型油菜品種花油8號衍生純系H008為親本構(gòu)建F1DH群體，并以此為研究群體利用甘藍(lán)型油菜60K SNP芯片分型技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜，結(jié)合云南傳統(tǒng)油菜高產(chǎn)區(qū)麗江與臨滄試驗點2016-2017年DH群體含油量分析數(shù)據(jù)進行含油量性狀QTL分析。再結(jié)合甘藍(lán)型油菜參考基因組序列信息，利用Blast分析技術(shù)將QTL掃描結(jié)果與前人含油量QTL定位區(qū)間開展比較分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探知G28高含油量性狀遺傳規(guī)律，定位含油量性狀主效QTL位點，為今后進一步解析G28高含油量性狀遺傳機制及利用該種質(zhì)材料開展分子標(biāo)記輔助高含油量品種選育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高油種質(zhì)G28為云南省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所油菜中心通過種質(zhì)創(chuàng)新獲得含油量穩(wěn)定在50 %左右的純系[6]，低油材料H008為云南甘藍(lán)型油菜推廣品種花油8號衍生純系，含油量穩(wěn)定在40 %左右。以G28為母本，H008為父本利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)[16]創(chuàng)建了包含175份株系的F1DH群體。2016年10月，175份DH株系及親本分別播種在臨滄(云南省臨滄市博尚鎮(zhèn)勐準(zhǔn)村，23°43′03″N，100°03′19″E，海拔1819.50 m)和玉龍(麗江市玉龍縣黃山鎮(zhèn)長水村，26°51′54″N，100°11′59″E，海拔2378.8 m)試驗點，隨機區(qū)組排列，2重復(fù)。五葉期每行10株定植，行間距30 cm，株間距20 cm，田間管理依據(jù)育種實踐進行?；ㄆ谧杂墒诜?，開放結(jié)實。成熟期株系收獲，懸掛于儲藏室，自然風(fēng)干30 d后，單株脫粒。

1.2 DNA提取與SNP芯片分析

DH群體及雙親材料在云南省農(nóng)科院科研創(chuàng)新大樓實驗室內(nèi)發(fā)芽，子葉平展時單株取樣。采用天根高效植物基因組DNA提取試劑盒(DP350)依據(jù)使用說明提取DH株系及雙親材料DNA。利用甘藍(lán)型油菜60K SNP芯片(Illumina Infinium HD Assay)[17]對DH株系及雙親DNA進行基因分型，分型實驗在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室開展。

1.3 油菜籽粒含油量近紅外檢測與數(shù)據(jù)分析

采用FOSS NIPSystem近紅外快速品質(zhì)分析儀(Type:461040；Model：5000；掃描波長：1100～2500 nm)對DH株系單株收獲籽粒進行含油量分析。每株系/重復(fù)測量10個單株，計2重復(fù)20單株數(shù)據(jù)取均值為株系含油量，具體儀器操作參見張美華等報道[18]。采用Excel對群體含油量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.4 遺傳連鎖作圖與QTL掃描

利用軟件JoinMap4.0結(jié)合MSTMap[19]計算DH株系SNP位點遺傳距離并繪制高密度遺傳連鎖圖譜，具體數(shù)據(jù)篩選及參數(shù)設(shè)置參見Liu等[20]報道。

利用IciMapping4.1軟件ICIM-ADD模型[21]對2016-2017年臨滄與玉龍兩點DH群體株系含油量數(shù)據(jù)進行含油量性狀QTL位點掃描，參數(shù)設(shè)置為Missing Phenotype: Deletion，Step：1.00，LODThredhold: 2.50。

1.5 甘藍(lán)型油菜參考基因組本地化數(shù)據(jù)庫搭建與SNP芯片探針序列Blast分析

從甘藍(lán)型油菜序列數(shù)據(jù)庫(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)下載甘藍(lán)型油菜基因組“Darmor-bzh”序列到本地計算機，使用blast+2.7.1軟件包搭建本地化甘藍(lán)型油菜參考基因組數(shù)據(jù)庫。提交SNP芯片探針序列到本地化數(shù)據(jù)庫進行Blast分析，參數(shù)為Evalue: e-18，允許1個堿基錯配。具體操作參見俎峰等報道[22]。

圖1 臨滄點DH群體含油量頻率分布Fig.1 The frequency distribution of oil content of 175 DH lines in Lincang

2 結(jié)果與分析

2.1 親本與DH群體含油量表型分布

175份DH株系含油量在玉龍與臨滄點均呈現(xiàn)正態(tài)分布，表現(xiàn)出負(fù)向超親分離，未有超過高含油量親本G28的DH株系。其中麗江點，DH群體含油量連續(xù)分布區(qū)間為33.53 %～47.19 %，平均含油量41.47 %，其中最低含油量株系較低含油量親本H008低6.75 %，而最高含油量株系較高含油量親本低3.07 %；臨滄點含油量連續(xù)分布區(qū)間為35.16 %～45.85 %，均值為42.27 %，其中最低含油量株系較低含油量親本H008低4.77 %，而最高含油量株系較高含油量親本低3.27 %，整體分布較玉龍點數(shù)據(jù)更為集中(圖1～2，表1)。

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建與含油量性狀QTL掃描

甘藍(lán)型油菜60 K SNP 芯片共計包含51 257個SNP探針位點，其中20 183個SNP位點在雙親G28與H008間表現(xiàn)出差異，數(shù)據(jù)分析評估后有7821個群體單一基因型SNP位點用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。利用JoinMap4.0與MSTmap作圖軟件構(gòu)建了19個連鎖群總長3838.2 cM，包含7601個SNP位點的高密度遺傳連鎖圖譜(圖3，封三)。利用該遺傳連鎖圖譜結(jié)合2016-2017年玉龍與臨滄試驗點DH群體含油量考種數(shù)據(jù)，使用QTL ICIMapping 4.1軟件ICIM-ADD模型進行含油量性狀QTL掃描分析。以LOD>2.5為閾值設(shè)置，共計檢測到6個含油量性狀QTL，分別可解釋表型變異率6.29 %～10.36 %。其中玉龍點檢測到4個QTL，分別位于A01，A10，C05與C08連鎖群上，命名為qOCa01.1，qOCa10.1，qOCc05.1與qOCc08.1，這4個QTL累計可解釋26.67 %的表型變異；臨滄點檢測到2個QTL，分別位于A10與C05連鎖群上，命名為qOCa10.2與qOCc05.2，累計可解釋18.56 %的表型變異。未檢測到2個環(huán)境下共有的QTL(表2)。

圖2 玉龍點DH群體含油量頻率分布圖Fig.2 The frequency distribution of oil content of 175 DH lines in Yulong

2.3 含油量性狀主效QTL映射參考基因組

提交12個含油量QTL峰值區(qū)間左右兩側(cè)的SNP位點(表2)探針序列到本地化參考基因組數(shù)據(jù)庫進行blast分析，所有SNP探針序列(50個堿基)均100 %定位到參考基因組位點中(表3)。由此可以將檢測到的含油量QTLqOCa01.1，qOCa10.1，qOCc05.1，qOCc08.1，qOCa10.2與qOCc05.2分別映射到參考基因組chrA01:18199776～18537648，chrA10:12518784～12601669，chrC05:37145291～38565229，ChrC08:19676216～20089898，ChrA10:14708940～14783747與Chr05: 1042668～1070281 區(qū)間內(nèi)。

表1 親本及DH株系含油量性狀表現(xiàn)

表2 含油量性狀QTL及其遺傳效應(yīng)

表3 含油量QTL兩側(cè)SNP標(biāo)記Blast結(jié)果

與Raboanatahiry等[23]繪制的含油量及相關(guān)性狀QTL映射圖譜比較分析發(fā)現(xiàn)，qOCa01.1位點與前人報道的qC18:2-A1-SO與qC16:0-A1-SO區(qū)間重疊；qOCa10.1位點與前人報道的qOC-A10-3-KN區(qū)間重疊；qOCa10.2位點與前人報道的qOC-A10-1-KN區(qū)間重疊；qOCc08.1位點與前人報道的qOC-C8-2-SG區(qū)間緊密相鄰；而qOCc05.1與qOCc05.2位點則在前人研究中未有對應(yīng)的重疊或緊密相鄰的QTL，推測為新的與油菜籽含油量相關(guān)的QTL。

3 討 論

3.1 油菜籽含油量性狀具有較強的遺傳與環(huán)境互作效應(yīng)

前人研究表明油菜籽粒含油量性狀作為數(shù)量性狀具有很高的遺傳力，同時也發(fā)現(xiàn)含油量性狀易受環(huán)境影響[7-9]。Guo等利用含油量各異的品種/自交系開展9×9完全雙列雜交，分析油菜種子含油量的遺傳及基因與環(huán)境互作效應(yīng)。GoCGm分析表明甘藍(lán)型油菜籽粒含油量形狀主要由遺傳效應(yīng)及基因與環(huán)境互作效應(yīng)決定，兩者可解釋總表型變異的86.19 %，而這其中基因與環(huán)境互作效應(yīng)在總遺傳變異占比高達(dá)51.68 %。這預(yù)示著在高含油量育種中，基因型與環(huán)境互作效應(yīng)不容忽視。這也部分解釋了各國研究學(xué)者累計在甘藍(lán)型油菜的19條連鎖群上鑒定了近百個含油量及含油量相關(guān)性狀的QTLs，卻鮮有穩(wěn)定一致性的QTLs報道[15, 24-27]。因此基于服務(wù)云南地區(qū)油菜含油量提升的目的，十分有必要自主開展遺傳連鎖作圖與含油量QTL研究。同時，玉龍與臨滄地區(qū)是云南油菜傳統(tǒng)高產(chǎn)區(qū)，其中臨滄市在2016年更是創(chuàng)造了“畝產(chǎn)、百畝連片、千畝連片”3項全國最高記錄，1.2畝理論畝產(chǎn)高達(dá)456.47 kg[28]，選擇這2個環(huán)境開展DH群體含油量性狀數(shù)據(jù)調(diào)查與QTL分析，對于今后推動云南油菜產(chǎn)業(yè)朝向高產(chǎn)、高含油量發(fā)展具有具有一定意義。

3.2 含油量QTL位點比較分析

由于前人研究含油量所使用的群體、分子標(biāo)記類型及種植環(huán)境各不同，這些檢測到的含油量QTL位點之間一直難以直接開展比較分析[9,23,29-30]。近年來隨著甘藍(lán)型油菜參考基因組序列信息的公布與60K SNP芯片的廣泛應(yīng)用極大的推動了甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜整合與含油量QTL比較分析研究。Raboanatahiry等通過Blast分析，映射9張已報到的甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜上的含油量QTL位點與脂肪酸QTL到參考基因組“Darmor-bzh”上，共鑒定出335個值得關(guān)注的脂肪酸與含油量相關(guān)的QTLs，其中82個QTLs彼此間存在重疊[23]。將本研究檢測到的6個含油量QTL利用同樣的方法映射到參考基因組“Darmor-bzh”后，與前人研究進行比較分析，發(fā)現(xiàn)其中4個QTL在前人研究中均有對應(yīng)的重疊或鄰近的QTL報道。qOCc05.1與qOCc05.2則沒有對應(yīng)的重疊或鄰近的QTL報道，推測qOCc05.1與qOCc05.2為新的含油量性狀相關(guān)的QTL。

3.3 下一步需要開展的工作

QTL作圖是利用分子標(biāo)記，把控制數(shù)量性狀的基因作為一個整體定位在染色體上，并估計其遺傳效應(yīng)，其結(jié)果可以幫助育種者獲得目標(biāo)性狀的遺傳信息，并借助與之連鎖的標(biāo)記在育種群體中選擇有利的等位基因型，進而提高選育的準(zhǔn)確性和預(yù)見性[31]。良好的QTL作圖是基因精細(xì)定位、克隆以及有效開展分子育種的基礎(chǔ)，其結(jié)果的準(zhǔn)確度與精確度主要受到作圖群體大小，標(biāo)記數(shù)目及表型數(shù)據(jù)調(diào)查三方面的影響。本研究以175份DH株系為研究材料，最終利用7821個SNP位點構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并在兩個環(huán)境下分別檢測到4和2個含油量QTL，但未檢出一致性的QTL。為檢驗這些QTL的穩(wěn)定性與可重復(fù)性，在下一步研究中可考慮增加DH株系的數(shù)量及在玉龍與臨滄環(huán)境下做多年試驗，同時在DH株系田間收獲時需要依據(jù)成熟度分批取樣，獲得準(zhǔn)確的田間表型數(shù)據(jù)，進而提升QTL掃描的準(zhǔn)確度與精度。這將有助于今后精細(xì)定位主效含油量QTL與分子標(biāo)記輔助高含油量油菜育種。

4 結(jié) 論

利用適宜于云南地區(qū)生產(chǎn)的高、低含油量雙親材料構(gòu)建F1DH群體，采用甘藍(lán)型油菜60K SNP芯片，結(jié)合玉龍與臨滄試驗點2016-2017年DH群體含油量數(shù)據(jù)，共挖掘到6個含油量性狀QTL，分別位于A01，A10，C05與C08連鎖群上，命名為qOCa01.1，qOCa10.1，qOCc05.1，qOCc08.1，qOCa10.2與qOCc05.2。Blast分析技術(shù)將這6個QTL位點映射到參考基因組-“Darmor-bzh” chrA01:18199776～18537648，chrA10:12518784～12601669，chrC05:37145291～38565229，ChrC08:19676216～20089898，ChrA10:14708940～14783747與Chr05: 1042668～1070281區(qū)間內(nèi)。與前人研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)qOCc05.1與qOCc05.2沒有對應(yīng)的重疊或鄰近的QTL報道，推測qOCc05.1與qOCc05.2為新的含油量性狀相關(guān)的QTL。研究的定位結(jié)果可為下一步精細(xì)定位主效QTL與分子標(biāo)記輔助高含油量油菜育種提供數(shù)據(jù)支持。