王田田，馬沁沁，苗玉志 ，周 霞

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101)

【研究意義】幾丁質(zhì)來源非常豐富，是自然界中僅次于纖維素的第二大類生物高聚物[1-2]，由于其分解非常緩慢而大量堆積造成環(huán)境嚴(yán)重污染[3]。幾丁質(zhì)酶能高效降解幾丁質(zhì)，其降解的小分子幾丁寡糖在食品保健、醫(yī)藥、飼料添加劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，因而有關(guān)幾丁質(zhì)酶及其產(chǎn)酶微生物的研究非常活躍[4-5]。傳統(tǒng)上，幾丁質(zhì)降解的研究主要集中在基于溫和條件及減少污染的酶催化降解方法的開發(fā)，在這些研究中，常常需要對(duì)幾丁質(zhì)原料采用酸或堿預(yù)處理，這需要后續(xù)發(fā)酵降解所需微生物酶能夠在酸性或堿性條件下發(fā)揮催化作用，在以往報(bào)道的微生物中所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶以中性居多[6]，近來分離得到了產(chǎn)堿性幾丁質(zhì)酶的微生物[7]，而產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶微生物的研究報(bào)道極少[8]，加之現(xiàn)有微生物的酶學(xué)性質(zhì)仍不能滿足工農(nóng)業(yè)應(yīng)用的需要[9]，因此提高幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)酶水平和性能已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[10-11]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今，已有許多幾丁質(zhì)酶的相關(guān)報(bào)道[12-13]，而在產(chǎn)幾丁質(zhì)酶放線菌的研究中，由于放線菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶具有獨(dú)特的酶學(xué)特征，表現(xiàn)出對(duì)熱、pH較強(qiáng)的穩(wěn)定性，但這些酶基本上為中性幾丁質(zhì)酶[14]，所以開展高產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶放線菌的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。大量研究表明，放線菌廣泛分布于不同的土壤生態(tài)環(huán)境中[15]，它們通過產(chǎn)生各種酶高效調(diào)節(jié)土壤中有機(jī)質(zhì)的分解或合成，改善土壤肥力，促進(jìn)植物生長[16-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】塊菌(Tuberspp.)作為典型的地下外生菌根真菌，同微生物及植物間相互作用、協(xié)同共生，具有重要的生態(tài)作用，其偏酸性的菌根土壤中豐富的幾丁質(zhì)是塊菌生長所需的重要多糖類營養(yǎng)源之一，它們被特定功能的微生物降解后釋放單糖物質(zhì)并促進(jìn)塊菌的生長[19]。此外，在該環(huán)境中生活的微生物為適應(yīng)這種特定生境，必然具備相應(yīng)的催化活性的酶系，因而塊菌根際土壤中富含大量產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的放線菌[20-22]。迄今，雖然有關(guān)塊菌菌根土壤微生物及其功能研究不斷有新發(fā)現(xiàn)，但極少針對(duì)塊菌菌根土壤特定功能放線菌多樣性的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從我國西南塊菌自然產(chǎn)區(qū)特定生境菌根土壤中分離篩選高產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶的放線菌并鑒定，對(duì)菌株的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在獲得具有特定酶學(xué)性質(zhì)的酸性幾丁質(zhì)酶的放線菌，為幾丁質(zhì)酶的工業(yè)化應(yīng)用提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 土壤樣本采集于四川攀枝花地區(qū)印度塊菌自然產(chǎn)區(qū)具有代表性的3個(gè)生態(tài)位點(diǎn)的菌塘(26°35′02N/101°66′76E，26°38′96N/101°67′01E，26°62′66N/101°51′44E)。在每個(gè)位點(diǎn)，用無菌小鏟于5～8 cm處取約200 g菌根土壤樣品混合均勻作為土樣，存放于無菌樣品袋帶回實(shí)驗(yàn)室貯藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①放線菌分離培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉 20、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO40.5、NaCl 0.5、KNO31.0、瓊脂15，補(bǔ)充50 mg/L的制霉菌素和50 mg/L萘啶酮酸抑制真菌和其他細(xì)菌的生長；②幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：膠體幾丁質(zhì) 12.5、蛋白胨 2、K2HPO40.5、KNO31、NaCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、瓊脂 15.0；③種子培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20，K2HPO40.5，KNO31.0，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01；④發(fā)酵培養(yǎng)基：粉狀幾丁質(zhì) 12.5、蛋白胨 2、K2HPO40.5、KNO31、NaCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01。

1.1.3 主要試劑及儀器TaqDNA 聚合酶和DNA marker：上海英俊生物公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒：天根生物公司；細(xì)粉幾丁質(zhì)：成都康迪生物公司；N-乙酰-D-氨基葡萄糖和大豆粉：博奧維新試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。恒溫培養(yǎng)箱(THZ-300)：上海恒科儀器有限公司；自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(G154DW)：廈門致微儀器有限公司；7200型可見分光光度計(jì)：上海尼龍柯儀器有限公司；梯度熱循環(huán)PCR擴(kuò)增儀：德國耶拿公司；凝膠成像系統(tǒng)：Bio-RAD公司。

1.2 產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶放線菌的分離和鑒定

1.2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶放線菌的分離 取約1.0 g樣本土壤用無菌水適度稀釋后分別涂布于放線菌分離平板28 ℃培養(yǎng)5 d，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌株相似性初篩后，涂布幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌分離平板，于28 ℃培養(yǎng)72 h，挑選透明圈明顯的單個(gè)菌落分別接入液體篩選培養(yǎng)基，于28 ℃下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵72 h，結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的酶活力。

酶活力測(cè)定參考Imoto方法[23]進(jìn)行：取5 mL發(fā)酵液于3000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL加入用磷酸緩沖液(pH 7.0)配制的1.0 %膠體幾丁質(zhì)溶液1 mL，30 ℃水浴30 min，加DNS試劑2.0 mL，沸水浴10 min，迅速冷卻至室溫，測(cè)定OD540，根據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。酶活單位定義(U)：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，1 min催化產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

1.2.2 產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶放線菌的篩選 為獲得產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶的放線菌，在40 ℃條件下，分別測(cè)定去重復(fù)后的各菌株在pH 2.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中幾丁質(zhì)酶活力，以酶活力最高者為100 %，計(jì)算各菌株在酸性條件下的相對(duì)酶活力，獲取產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶菌株。

1.2.3 產(chǎn)酸性酶菌株的16S rDNA鑒定 菌株的16S rDNA基因組采用試劑盒提?。籔CR擴(kuò)增采用通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)，擴(kuò)增體系為：10×Buffer 2.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq酶(5 U/μl) 0.2 μl，dNTPs (2.5 mmol/μl) 2 μl，引物 (10 pmol/μl)各1 μl，補(bǔ)水至25 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增得到的16S rDNA 片段用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳分離，送成都擎科生物公司測(cè)序，所得序列通過GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取參比菌株用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過NCBI獲取序列登錄號(hào)。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1 幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE檢測(cè) 幾丁質(zhì)酶的純化及檢測(cè)參照張新軍等[24]的方法稍作修改：吸取1 mL 3 %膠體幾丁質(zhì)加入到1.5 mL離心管中，8000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入幾丁質(zhì)酶發(fā)酵上清液1 mL，將膠體幾丁質(zhì)沉淀重懸，于30 ℃恒溫10 min(讓幾丁質(zhì)酶充分吸附于膠體幾丁質(zhì)顆粒表面)，8000 r/min 離心5 min，棄上清液，沉淀用蒸餾水重懸，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，溫育 72 h，讓幾丁質(zhì)酶把膠體幾丁質(zhì)充分降解，然后12 000 r/min離心5 min 除去未被降解的雜質(zhì)，即為待測(cè)幾丁質(zhì)酶樣品，該樣品采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)其大小。

1.3.2 初始pH和溫度對(duì)酶活力的影響 分別將200 μl純化幾丁質(zhì)酶液與800 μl不同pH值(pH 3～10)的緩沖液混勻， 在不同溫度 (35～80 ℃，間隔5 ℃)條件下測(cè)酶活力，以酶活力最高者為100 %，計(jì)算不同pH、不同溫度條件下的相對(duì)酶活力，確定最適反應(yīng)pH和溫度。

1.3.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響 在幾丁質(zhì)酶與底物反應(yīng)的體系中，分別添加終濃度為50 mmol/L的不同金屬離子(Ag+、Cs+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+、Al3+和Ni+)，最適溫度下水浴30 min測(cè)酶活力，以不加金屬離子反應(yīng)體系的酶活力為100 %，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.3.4 蛋白抑制劑對(duì)酶活力影響 在反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為0.5 mol/L的蛋白抑制劑EDTA、尿素、SDS和β-巰基乙醇，最適溫度下水浴30 min，分別測(cè)定各反應(yīng)體系中幾丁質(zhì)酶活力，以不加任何抑制劑的酶活力為100 %，分別計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.5 pH和熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 將純化幾丁質(zhì)酶液于pH 3～10的條件下保溫60 min取樣，于最適pH和溫度下測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力；另將酶液分別置于25、35、45、55和65 ℃的溫度下保溫10、20、30、40、50和60 min，然后迅速冷卻至最適反應(yīng)溫度，在最適pH和溫度下測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力。以未處理的酶液酶活力為100 %，分別計(jì)算各pH和溫度下幾丁質(zhì)酶的殘存酶活力的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株分離

采用放線菌分離培養(yǎng)基，從土壤樣本中分離到125株放線菌，經(jīng)純化后再平板培養(yǎng)獲得各菌株單菌落，對(duì)各菌株菌落形態(tài)和顯微涂片觀察，根據(jù)各菌株菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)初篩去重復(fù)得到57株放線菌，對(duì)這些菌株依次編號(hào)為SCPW01-SCPW57，經(jīng)產(chǎn)酶篩選平板培養(yǎng)后測(cè)定透明圈直徑，選取透明圈大于5 mm的單菌落，經(jīng)純化培養(yǎng)后搖瓶發(fā)酵，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，得到17株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力相對(duì)較高的放線菌菌株，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，包括有SCPW01、SCPW03、SCPW19、SCPW20、SCPW50和SCPW55等在內(nèi)的部分菌株的透明圈直徑和幾丁質(zhì)酶活呈正相關(guān)性，透明圈直徑越大幾丁質(zhì)酶活力越高；但是SCPW02、 SCPW10、SCPW30、SCPW39、SCPW49和SCPW54等菌株的透明圈直徑和幾丁質(zhì)酶活相關(guān)性極小。另外，獲得了一些初酶活力相對(duì)較高的菌株，如編號(hào)為SCPW03的菌株酶活力為30.2 U/mL，菌株SCPW30酶活力為19.1 U/mL。

2.2 產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶菌株篩選

對(duì)17株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的放線菌所產(chǎn)酶酶活采用不同pH緩沖液(pH 2、pH 3、 pH 4、 pH 5和pH 6)處理，酶活測(cè)定結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株SCPW31、SCPW49、SCPW53和SCPW54在pH 2～6內(nèi)均沒有活性；菌株SCPW01、SCPW10、SCPW17、SCPW30和SCPW55在pH 2～4沒有活性，而在范圍pH 5～6內(nèi)表現(xiàn)出輕微的催化活性，且隨pH值增加催化活性逐漸增強(qiáng)；菌株SCPW34和SCPW39在pH值為 5～6范圍內(nèi)有48.1 %～85.2 %的活性外，其它菌株SCPW02、SCPW03、SCPW19、 SCPW20、SCPW38和SCPW50在pH 2～6的范圍內(nèi)都表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的酶活性。因此，通過試驗(yàn)共獲得了8株酸性幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌，并對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定。此外，我們發(fā)現(xiàn)菌株SCPW03所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶在pH 3～4范圍內(nèi)催化活性極高，超過95.4 %，而在pH 2的酸性條件下相對(duì)酶活性也大于75 %，表明該酶在極低酸值環(huán)境條件下能夠充分保持其酶活性，為嗜酸幾丁質(zhì)酶。因而擬對(duì)該菌株進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.3 產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶菌株的鑒定

對(duì)8株產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶菌株進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果同NCBI中的核酸序列比對(duì)并進(jìn)行序列相似度分析，8株放線菌同GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性最高的菌株的相似性在97 %～100 %，其中相似度低于98 %的有2株菌，相似度在98 %～100 %的有4株，1株菌的相似度為100 %，但沒有相似度低于97 %的菌株獲得，基因序列登錄NCBI獲得登錄號(hào)(表1)。

圖1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選結(jié)果Fig.1 Screening of producing-chitinase strains

圖2 17株菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶在酸性條件下的相對(duì)酶活力Fig.2 Relative activity of chitinase from 17 strains under acidic condition

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析顯示8株產(chǎn)酶放線菌產(chǎn)生了2個(gè)不同的分類單元，這些菌株能夠被完全區(qū)分開，但所有菌株都?xì)w于鏈霉菌屬(Streptomyces)，分布于可能的8個(gè)種，表明這些菌株間存在不同的遺傳多樣性，也表明了一個(gè)相對(duì)較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系(圖3)?；谶M(jìn)化樹分析，8株幾丁質(zhì)酶放線菌產(chǎn)生菌被鑒定和暫命名(表1)。

2.4 S. omiyaensis SCPW03酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 SDS-PAG及酶譜分析 菌株S.omiyaensisSCPW03發(fā)酵粗酶液的酶譜分析(圖4 Lane 1)和純化所得幾丁質(zhì)酶蛋白SDS-PAGE電泳(圖4 Lane 2)所示。由圖4 Lane 1可知，發(fā)酵液里包含有至少5個(gè)蛋白條帶， 圖4 Lane 1表明該菌株至少產(chǎn)生并向胞外分泌5種以上不同分子質(zhì)量的幾丁質(zhì)酶，其中部分條帶在SDS-PAG凝膠上顯示不是很清晰，但呈現(xiàn)明顯條帶，推測(cè)其具有較高的酶活性。這與塊菌生境菌根土壤中該菌株高效降解幾丁質(zhì)有密切關(guān)系。經(jīng)過純化后得到優(yōu)勢(shì)帶Lane 2，對(duì)照蛋白質(zhì) Marker可知該蛋白分子量約為54 kDa的蛋白為S.omiyaensisSCPW03分泌的優(yōu)勢(shì)酸性幾丁質(zhì)酶。

表1 8株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶放線菌16S rRNA基因分析及親緣關(guān)系

圖3 基于8個(gè)菌株的16S rDNA 序列同源性的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 8 strains based on 16S rDNA sequences between the representative actinobacteria and the nearest type strains

2.4.2 pH和溫度對(duì)酶活力的影響 如圖5-A 所示，菌株S.omiyaensisSCPW03分泌的幾丁質(zhì)酶經(jīng)不同pH緩沖液處理后，發(fā)現(xiàn)該酶在pH 3～9范圍內(nèi)催化活性均>70 %，而在pH 3～4時(shí)能夠保持極高的酶活，相對(duì)酶活性均超過95 %，該酶具有較廣泛的保持活性的pH范圍，而在較低的pH條件下活性最大，再次表明該酶屬于嗜酸性幾丁質(zhì)酶。

如圖5B 所示，菌株S.omiyaensisSCPW03產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶在25～45 ℃的溫度范圍內(nèi)催化活性最高(>95 %)，而在45～65 °C范圍內(nèi)也具有較高的催化活性(>80 %)。繼續(xù)升高溫度酶活性明顯降低，這是由于高溫能夠改變蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酶的活性。因此，菌株S.omiyaensisSCPW03具有較寬的催化溫度，最適催化溫度為25～45 ℃，該酶為中溫酶。

Lane 1：幾丁質(zhì)酶粗酶液的酶譜，Lane 2：純化幾丁質(zhì)酶M: prestained protein ladder, Lane 1: the zymogram of the crude chintinase of S. omiyaensis SCPW03, lane 2: purified protein圖4 菌株SCPW03產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of chitinase from SCPW03

圖5 pH和溫度幾丁質(zhì)酶活力的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on chitinase activity

2.4.3 金屬離子和化學(xué)抑制劑對(duì)酶活力的影響 如圖6A所示，終濃度均為50 mmol/L的Ag+，Cs+，Cu2+，F(xiàn)e2+， Mn2+、Zn2+、Mg2+，Ca2+、K+、Na+、Al3+和Ni+對(duì)菌株S.omiyaensisSCPW03產(chǎn)生的酶活性具有明顯不同的作用。其中，Ag+、Cs+、Mg2+、Al3+和Ni+對(duì)酶活力抑制作用顯著(P<0.05)，相對(duì)酶活性均低于45 %；而Cu2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+對(duì)酶活性影響較小，相對(duì)酶活性均大于85 %；Fe2+、Mn2+則能夠顯著促進(jìn)幾丁質(zhì)酶活性。

化學(xué)抑制劑EDTA、SDS和β-巰基乙醇對(duì)酶活性影響較小(圖6B)，表明S.omiyaensisSCPW03對(duì)這些化學(xué)抑制劑具有較好的抗性；而尿素對(duì)酶活性具有一定的抑制作用，這可能是因?yàn)槟蛩仄茐牧说鞍踪|(zhì)分子中的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松弛，從而使其變性。

2.4.4 酶的pH和熱穩(wěn)定性 將粗酶液分別于pH 3.0～10.0范圍內(nèi)，在35 ℃條件下保溫60 min取樣，于最適pH和溫度條件下測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，結(jié)果表明幾丁質(zhì)酶在pH 6.0的偏酸性條件下最穩(wěn)定，pH低于5.0或者大于7.0后酶活力迅速降低，說明該pH對(duì)幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性影響很大(圖7A)；熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖7B)，25和35 ℃保溫60 min，相對(duì)酶活保持在90 %以上，當(dāng)溫度超過45 ℃，幾丁質(zhì)酶活力在30 min以內(nèi)其相對(duì)酶活仍然保持在90%，當(dāng)超過30 min后酶活力迅速下降，可見該酶具有較寬的pH和溫度作用范圍。

3 討 論

功能微生物的研究有利于人類更好地挖掘和利用微生物資源。特定生境土壤是探索和分離鑒定幾丁質(zhì)降解細(xì)菌最具活力的自然資源[25]。細(xì)菌幾丁質(zhì)酶是幾丁質(zhì)降解的主要因素，比如芽孢桿菌屬細(xì)菌是眾所周知的產(chǎn)高水平幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)者[26-27]。由于產(chǎn)幾丁質(zhì)酶放線菌潛在的生物活性，近年來得到了大量研究[ 28]。然而，很少關(guān)于產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)放線菌的研究報(bào)道[8]。

當(dāng)前研究從攀枝花地區(qū)塊菌菌根土壤中分離到8株產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶放線菌，其酶產(chǎn)量范圍為5.5～30.0 U/mL，這一結(jié)果相比來源于其它大多數(shù)野生型細(xì)菌和真菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶要高，比如Conidioboluscoronatus(0.26 U/mL)[29]、Streptomycessp. (0.27 U/mL)[30]和Bacillussp. (2.24 U/mL)[31])、Verticilliumlecanii(18.2 mU/mL)[32]、Lecanicilliummuscarium(0.243 U/mL)[33]、Paenibacillussp. (11.86 U/mL)[34]。由于攀枝花地區(qū)塊菌生境菌根土壤為偏酸性土壤，而來源于塊菌菌根土壤的放線菌可能與塊菌的生長密切相關(guān)，因而從菌株篩選結(jié)果來看攀枝花地區(qū)塊菌菌根土壤是分離產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶放線菌的理想之地。

圖6 金屬離子和蛋白抑制劑對(duì)酶催化活性的影響Fig.6 Effect of metal ions and protein inhibitor on chitinase activity

圖7 pH(A)和溫度(B)對(duì)幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of pH and temperature on stability of chitinase

通過對(duì)高產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶菌株S.omiyaensisSCPW03的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶蛋白純化后的分子大小為54.0 kDa，其大小明顯低于其它細(xì)菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶蛋白(70.0、74.0 kDa)[35-36]，但是關(guān)于該菌所產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶的基因及其表達(dá)后蛋白性質(zhì)還需要進(jìn)一步研究。菌株S.omiyaensisSCPW03所產(chǎn)酶對(duì)不同金屬離子表現(xiàn)出明顯不同的作用，其中，Ag+、Cs+、Mg2+、Al3+和Ni+對(duì)酶活力抑制作用顯著，相對(duì)酶活性均低于45 %；而Cu2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+對(duì)酶活性影響較小；Fe2+、Mn2+能夠顯著提高其活性?；瘜W(xué)抑制劑EDTA、SDS和β-巰基乙醇對(duì)酶活性影響較小，而尿素對(duì)酶活性具有一定的抑制作用，這可能是因?yàn)槟蛩仄茐牧说鞍踪|(zhì)分子中的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松弛，從而使其變性。

S.omiyaensisSCPW03所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳活性pH值范圍為3.0～4.0，該數(shù)值比已經(jīng)報(bào)道的來源于Paenibacillussp. D1的酸性幾丁質(zhì)酶(pH 5.0)要低[37]，接近于Microbisporasp. V2(pH 3.0)[38]，表明該菌株所產(chǎn)酶是嗜酸幾丁質(zhì)酶。菌株S.omiyaensisSCPW03所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳活性pH是6.0，具有較寬的pH穩(wěn)定范圍為4.0～9.0，這和其它酸性幾丁質(zhì)的pH穩(wěn)定性相近[8]。該菌株所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳活性溫度范圍為25～45 ℃，最佳溫度為35 ℃，該溫度明顯低于Pseudomonassp. TKU015 (60 ℃)[39]和BacilluscereusIO8 (65 ℃)[40]，低溫更加有利于工業(yè)發(fā)酵；對(duì)熱穩(wěn)定性表明在低于65 ℃下持續(xù)30 min都較穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本研究從四川攀枝花塊菌菌根土壤中共分離到17株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶放線菌，通過在pH 2.0～6.0的酸性條件下的酶活力檢測(cè)，得到8株產(chǎn)酸性幾丁質(zhì)酶放線菌。基于16S rDNA基因測(cè)序鑒定表明8株菌均為鏈霉菌屬的8個(gè)種，并對(duì)其命名。從中篩選出一株產(chǎn)酶量最高的S.omiyaensisSCPW03菌株進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，該菌株所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的分子量約為54 kDa；酶活最適反應(yīng)溫度為35 ℃，在25～65 °C的溫度范圍內(nèi)具有較高的催化活性；最適反應(yīng)pH為4.0，該酶具有較寬的pH穩(wěn)定作用范圍(pH 3.0～9.0)；金屬離子Cu2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+及化學(xué)抑制劑EDTA、SDS和β-巰基乙醇對(duì)酶活性影響較小，而Fe2+、Mn2+則能顯著促進(jìn)幾丁質(zhì)酶活性，表明該酶對(duì)化學(xué)抑制劑較好的抵抗力。該菌所產(chǎn)酸性酶具有較多的優(yōu)良特征及較高的產(chǎn)量。今后可進(jìn)一步采用基因工程技術(shù)克隆該酸性幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建基因工程菌實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的高效表達(dá)，提高幾丁質(zhì)酶活力，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。