康偉偉，張 超，2，易自力，陳智勇，譚炎寧

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

【研究意義】磷脂酶廣泛存在于動(dòng)植物中，具有磷脂酶A1、A2、B、C和D等類(lèi)型，它們能特異地作用于磷脂分子的各個(gè)酯鍵，將其水解為脂肪酸及親脂性物質(zhì)[1]。植物磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)即磷脂酰膽堿磷脂水解酶(EC3. 1. 4. 4)，其作用底物較為寬廣(如底物有磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸等)，能專(zhuān)一性水解磷脂中的4位酯鍵生成磷脂和有機(jī)堿[2]，在脂質(zhì)代謝、生物膜形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及逆境響應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PLD作為植物磷脂酶家族的重要組成亞類(lèi)，其結(jié)構(gòu)和功能越來(lái)越受到關(guān)注。擬南芥基因組中共存在12個(gè)PLD成員，根據(jù)其序列相似性及蛋白結(jié)構(gòu)域的不同被分成α、β、δ、γ和ζ等5種不同的亞型[4]。水稻PLD含有17個(gè)成員，預(yù)測(cè)其中16個(gè)為擬南芥PLD的同源蛋白，剩余一個(gè)在水稻中未被編碼；水稻PLD比擬南芥增加了φ和κ兩種亞型[5]。有趣的是，φ型PLD并不具有C2結(jié)構(gòu)域或PX/PH結(jié)構(gòu)域而含有一段信號(hào)肽，因此也被稱(chēng)為信號(hào)肽PLD(SP-PLD)[4-5]；φ型PLD已在葡萄、楊樹(shù)等多種植物中相繼被發(fā)現(xiàn)[6]。目前，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥PLD參與干旱、鹽和低溫等脅迫應(yīng)答。過(guò)表達(dá)AtPLDα1基因提高了植株對(duì)脫落酸ABA的敏感性，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，減少水分蒸騰散失，從而增強(qiáng)了植株的抗旱能力，而敲除株系則表現(xiàn)出相反的性狀[7-8]。在鹽脅迫條件下，AtPLDα1和AtPLDδ基因被激活；AtPLDα1的突變株出現(xiàn)了生長(zhǎng)缺陷，AtPLDα1、AtPLDδ的單突變體及其雙突變體對(duì)鹽敏感性增加[11,14]；類(lèi)似地，番茄LePLDα1在鹽脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，其突變細(xì)胞在鹽脅迫下活性顯著降低[11,15]；擬南芥AtPLDα3也被報(bào)道參與了鹽、脫水和ABA的響應(yīng)[10]。AtPLDδ與低溫響應(yīng)有關(guān)，AtPLDδ突變株在-7 ℃或更低溫度條件下其存活能力明顯低于野生型[11,16]。【本研究切入點(diǎn)】在水稻中，OsPLDζ1受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，OsPLDζ1的突變株在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)發(fā)育明顯緩慢，植株矮化且存活率下降[17]；OsPLDβ1通過(guò)激活A(yù)BA信號(hào)通路，抑制種子的萌發(fā)[18]。與之相反，OsPLDα3突變株在鹽脅迫條件下比野生型呈現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)狀況，表明OsPLDα3在鹽脅迫響應(yīng)中具有負(fù)調(diào)控作用[17]。但是目前，水稻PLD家族基因功能的研究相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了加強(qiáng)對(duì)該基因家族的深入認(rèn)識(shí)，本研究利用生物信息學(xué)手段分析了水稻16個(gè)磷脂酶PLD家族成員的基因結(jié)構(gòu)、蛋白域基序、時(shí)空表達(dá)以及激素誘導(dǎo)表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步研究該家族的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻PLD家族基因結(jié)構(gòu)分析方法

從Amarjeet Singh(2012)文獻(xiàn)中獲得水稻PLD家族基因的登錄號(hào)，通過(guò)在RGAP網(wǎng)站上搜尋并下載其基因組序列和CDS序列，然后在GSDS(Gene Structure Display Server 2.0)網(wǎng)站分析基因結(jié)構(gòu)。

1.2 水稻PLD家族蛋白基序分析方法

在Ensembl Plants網(wǎng)站上搜尋并下載水稻OsPLD家族蛋白序列，利用在線分析網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/)分析基序種類(lèi)與特征。

1.3 水稻PLD家族時(shí)空表達(dá)與激素誘導(dǎo)表達(dá)分析方法

從RiceXPro網(wǎng)站所公布4X44K Microarray芯片數(shù)據(jù)中提取OsPLD家族基因在葉、葉鞘、莖、根、花藥、子房等不同組織部位及營(yíng)養(yǎng)時(shí)期、生殖時(shí)期和成熟期等不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；此外，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取以種子萌發(fā)至生長(zhǎng)7 d的水稻嫩芽為樣本的激素(如脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素、油菜素內(nèi)酯、細(xì)胞分裂素和茉莉酸)處理表達(dá)數(shù)據(jù)，經(jīng)歸一標(biāo)準(zhǔn)化處理后使用MeV4.6作圖，得到PLD家族的時(shí)空表達(dá)譜熱圖及激素誘導(dǎo)表達(dá)譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻PLD家族基因結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)GSDS分析發(fā)現(xiàn)，水稻PLD家族成員基因長(zhǎng)度在2982 bp(OsPLDα5)～11 305 bp(OsPLDζ1)范圍內(nèi)(圖1)，絕大多數(shù)基因長(zhǎng)度大于4 kb，只有OsPLDα3、OsPLDα5和OsPLDα8等少數(shù)基因長(zhǎng)度少于4 kb，它們的長(zhǎng)度分別為3671、3793和2982 bp(圖1)。不同亞類(lèi)基因可能具有不同的外顯子數(shù)目，但同亞類(lèi)基因的外顯子數(shù)大致一致；α型外顯子數(shù)目最少，OsPLDα1、OsPLDα2、OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5和OsPLDα8的外顯子數(shù)量均只有3個(gè)(圖1)，β型(OsPLDβ1和OsPLDβ2)與δ型(OsPLDδ1、OsPLDδ2和OsPLDδ3)的外顯子數(shù)目相當(dāng)，均達(dá)到了10個(gè)，ζ型(OsPLDζ1)外顯子個(gè)數(shù)最多，達(dá)到了21個(gè)；而水稻中2個(gè)擬南芥不含有的φ和κ亞型成員(OsPLDφ和OsPLDκ)的外顯子數(shù)分別為7和6個(gè)。

2.2 水稻PLD家族蛋白基序分析

MEME在線分析蛋白序列基序特征發(fā)現(xiàn)，水稻PLD家族含有的氨基酸殘基數(shù)在511(OsPLDφ)～1164(OsPLDζ1)之間，大部分蛋白的基序集中分布在500～800位殘基區(qū)域；除OsPLDφ和OsPLDκ不含有共同基序外，其它成員要都含有2或3種共同基序，如，OsPLDζ1只含1、3基序而不包含基序2，而另14個(gè)成員都具有1、2和3基序?；?、2、3具體對(duì)應(yīng)的蛋白序列見(jiàn)圖2。

2.3 水稻PLD家族基因時(shí)空表達(dá)分析

通過(guò)提取水稻PLD家族基因的時(shí)空表達(dá)芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，該基因家族在不同組織部位和不同發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)不同的表達(dá)特性，一般在根、莖、葉、花藥、子房等部位表達(dá)相對(duì)較高，在胚芽、胚乳等部位表達(dá)較低。在α亞型中，除OsPLDα7在胚乳發(fā)育晚期表達(dá)較高而在葉中表達(dá)較低外，其它7個(gè)成員的表達(dá)趨勢(shì)整體一致，都在莖、葉、根中的表達(dá)相對(duì)較高；成員OsPLDα4和OsPLDα6表現(xiàn)出較為相似的表達(dá)規(guī)律，在胚和胚乳中表達(dá)較低。在β亞類(lèi)中，OsPLDβ1和OsPLDβ2的表達(dá)差異較大，OsPLDβ1在各部位中的表達(dá)水平普遍較低，而OsPLDβ2在各部位中的表達(dá)量要高于OsPLDβ1，特別是在子房和花藥中具有較高的表達(dá)量。對(duì)于δ型成員而言，其表達(dá)趨勢(shì)也不盡一致，OsPLDδ1在根中高表達(dá)，在胚乳和葉中表達(dá)較低；OsPLDδ2在花藥和子房中表達(dá)較高，在胚和胚乳表達(dá)較低；而OsPLDδ3在幼穗、子房和花藥等部位及胚胎整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量較高，在胚乳和葉中表達(dá)相對(duì)較低；另外，OsPLDφ、OsPLDζ1和OsPLDκ這3個(gè)成員分別在胚、子房、莖中表達(dá)相對(duì)較高(圖3)。

圖1 水稻PLD家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structural analysis of rice PLD-family genes

圖2 水稻PLD家族蛋白基序分析Fig.2 Protein motifs analysis of PLD-family in rice

2.4 水稻PLD家族激素誘導(dǎo)表達(dá)分析

誘導(dǎo)表達(dá)譜熱圖分析發(fā)現(xiàn)，水稻PLD家族在各種激素誘導(dǎo)下呈現(xiàn)出不同的表達(dá)響應(yīng)模式，一般受JA(茉莉酸)和ABA(脫落酸)誘導(dǎo)后表達(dá)水平發(fā)生的變化較明顯，而對(duì)其它激素的敏感性相對(duì)較低。在Dα亞型中，OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5、OsPLDα8能夠受JA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，在處理1 h后加即有較高的表達(dá)量并能維持至12 h；在ABA處理下，整體表達(dá)量偏低，處理后期的表達(dá)量(如6～12 h)要低于前期(如1 h)；OsPLDα1、OsPLDα2和OsPLDα7對(duì)JA的敏感性要低于其它α亞型成員，OsPLDα1和OsPLDα2分別在ABA處理后的3～12 h和6～12 h進(jìn)入高表達(dá)狀態(tài)。在β類(lèi)型中，OsPLDβ1、OsPLDβ2都受ABA誘導(dǎo)而增強(qiáng)表達(dá)，其中OsPLDβ1在IAA(吲哚乙酸)處理3 h時(shí)表達(dá)量明顯上升，OsPLDβ2在JA處理1 h時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)，處理6～12 h后表達(dá)下降。在δ型成員中，OsPLDδ2在JA處理下的表達(dá)受明顯抑制，在BR(油菜素內(nèi)酯)處理3 h時(shí)表達(dá)量較高，其它時(shí)間無(wú)明顯變化；OsPLDδ1和OsPLDδ3對(duì)各種激素的誘導(dǎo)似乎都不太敏感，OsPLDζ1在6～12 h、OsPLDζ3在12 h處受ABA微弱的誘導(dǎo)作用，但不明顯。對(duì)于OsPLDζ1而言，其表達(dá)受CTK(細(xì)胞分裂素)的微弱誘導(dǎo)，在其它激素處理下表達(dá)無(wú)明顯變化。另外，特有的φ型成員OsPLDφ在各種激素作用下表達(dá)無(wú)明顯變化，而κ亞型成員OsPLDκ在GA(赤霉素)和JA處理后都出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。

Leaf Blade: 劍葉; Leaf Sheath: 葉鞘; Root: 根; Stem: 莖; Inflorescence: 花序; Anther: 花藥; Ovary: 子房; Embryo: 胚; Endosperm: 胚乳; Vegetative: 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng); Reproductive: 生殖; ripening: 成熟; DAF: Day after flowering, 開(kāi)花后天數(shù)圖3 水稻PLD家族基因組織表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of PLD-family genes in rice tissue

ABA:脫落酸；GA:赤霉素；IAA:生長(zhǎng)素；BR:油菜素內(nèi)酯；CTK:細(xì)胞分裂素；JA:茉莉酸圖4 水稻PLD家族響應(yīng)激素誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig.4 Expression for rice PLD-family genes induced by hormone

3 討 論

目前，在擬南芥和番茄等植物中已鑒定了多個(gè)PLD家族成員[19-21]，發(fā)現(xiàn)PLD不僅能調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育而且還能響應(yīng)逆境脅迫[22-23]；但是，水稻中的相關(guān)報(bào)道較少。

生信分析是預(yù)測(cè)基因功能的基本研究手段。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管水稻PLD家族的基因長(zhǎng)度不論是在亞類(lèi)間還是同一亞類(lèi)中都存在著較大差異，但是同一亞型內(nèi)的各成員基本上都具有一致的外顯子數(shù)目，比如α亞型多數(shù)成員都具有3個(gè)外顯子，而β亞型和δ亞型都含有10個(gè)外顯子(圖1)；這表明所屬同一亞型的各成員具有進(jìn)化和功能上的保守性，而不同亞型間所呈現(xiàn)的外顯子數(shù)量多樣性暗示了它們可能在生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。經(jīng)蛋白基序分析發(fā)現(xiàn)，該家族整體上具有較高的相似性，除擬南芥不含有而水稻所特有的兩種新型成員OsPLDφ、OsPLDκ型在基序方面各含有一段信號(hào)肽序列外，其余成員都具有2種或3種共同的結(jié)構(gòu)域(圖2)，這表明大多數(shù)PLD可能具有相同的底物催化功能[20]，而OsPLDφ、OsPLDκ的蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的作用部位可能區(qū)別于其它成員。

有研究指出，PLD可以在各個(gè)植物組織器官(種子、果實(shí)、根、莖、葉等)中廣泛表達(dá)，并且集中在生長(zhǎng)代謝旺盛的部位，如成熟初期的種子和萌芽初期的幼苗[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻PLD的大部分成員在多數(shù)營(yíng)養(yǎng)器官中都有較高的表達(dá)水平，而在生殖器官中的表達(dá)較低，只有OsPLDα7、OsPLDδ3和OsPLDδ1等少數(shù)基因在在生殖生長(zhǎng)期的花序、胚或胚乳中較高表達(dá)；這說(shuō)明PLD成員通過(guò)多樣化的時(shí)空表達(dá)行為影響不同組織器官中的脂質(zhì)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)水稻生長(zhǎng)發(fā)育。

在激素誘導(dǎo)表達(dá)中，發(fā)現(xiàn)該家族成員能夠受不同激素影響表現(xiàn)出不同的應(yīng)答方式，整體對(duì)ABA和JA的響應(yīng)較為敏感，對(duì)BR和CTK無(wú)顯著變化。ABA是植物在逆境脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生的激素分子，擬南芥AtPLDα1、AtPLDα3等都與ABA有緊密聯(lián)系，過(guò)表達(dá)AtPLDα1株系對(duì)ABA敏感性提高，而AtPLDα3突變株對(duì)ABA敏感性增加[7-8,11]，這說(shuō)明PLD從不同方向響應(yīng)逆境。水稻OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5和OsPLDα8等成員在ABA處理后有被抑制傾向，而OsPLDα1、OsPLDβ1、OsPLDζ1有增強(qiáng)表達(dá)趨勢(shì)，這可能與其基因啟動(dòng)子區(qū)域存在ABA和逆境響應(yīng)元件有關(guān)[25]。此外，水稻PLD基因?qū)A具有較強(qiáng)的反應(yīng)，如OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5、OsPLDα8、OsPLDζ1和OsPLDκ等成員均受JA影響有一定的被誘導(dǎo)表達(dá)的傾向，而OsPLDα2、OsPLDβ2和OsPLDδ2等受JA影響有明顯的被抑制作用，故推測(cè)OsPLD成員很可能參與了JA介導(dǎo)的一些生物脅迫響應(yīng)途徑，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究對(duì)水稻PLD家族進(jìn)行了蛋白產(chǎn)物特征分析、組織時(shí)空以及響應(yīng)激素的表達(dá)譜分析，這些信息將為深入研究基因家族的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

水稻磷脂酶PLD家族族成員的基因長(zhǎng)度和外顯子數(shù)呈現(xiàn)多樣化特點(diǎn)，所屬同一亞型的各成員擁有較一致的外顯子數(shù)目；大部分成員含有相同類(lèi)型的基序，表明它們?cè)诠δ苌暇哂斜Ｊ匦院鸵恢滦浴４蠖鄶?shù)水稻PLD成員在胚和胚乳中表達(dá)量低，而在各個(gè)植物組織器官(種子、果實(shí)、根、莖、葉等)中廣泛表達(dá)；它們受ABA和JA誘導(dǎo)表達(dá)，而對(duì)BR和CTK處理不敏感，各成員在不同激素處理后表現(xiàn)出不同的應(yīng)答方式，暗示水稻PLD成員在逆境響應(yīng)中執(zhí)行不同的功能。本研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)水稻PLD家族的生物學(xué)功能提供了信息與參考。