蘇相文, 高方遠(yuǎn), 任鄄勝, 呂建群, 陸賢軍, 任光俊

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 四川 成都 610066)

【研究意義】目前，水稻育種的主要任務(wù)之一是在高產(chǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高稻米品質(zhì)[1-2]。水稻品質(zhì)性狀包括外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)，其中外觀品質(zhì)是最直觀的性狀，決定消費(fèi)者的購買欲望，細(xì)長型的稻米受到多數(shù)消費(fèi)者喜愛[3]。水稻籽粒的增長有利于粒重的增加[4]。因此，增加水稻粒長和長寬比能同時改良水稻外觀品質(zhì)和產(chǎn)量性狀。分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Marker-assisted Selection，MAS)可以大大提高育種效率、縮短育種周期，定向改良受體品種的目標(biāo)性狀，是現(xiàn)代分子育種的重要手段。利用MAS技術(shù)選擇粒長基因，培育新的長粒品種，對水稻生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的水稻粒長基因被定位[5-9]。目前，已經(jīng)被克隆的粒長基因有qGL3[10]和gs3[11]。Zhang等[10]指出qGL3編碼一個含有2個Kelch功能域的蛋白磷酸酶OsPPKL1，在水稻粒長調(diào)控中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)子的作用。Fan等[11]的結(jié)果表明gs3是調(diào)控水稻粒長的主效QTL，其等位基因gs3增加粒長[11]。在MAS育種應(yīng)用上，楊梯豐等[12]、李揚(yáng)等[13]和謝坤[14]進(jìn)行了報道，他們分別利用gs3基因功能性分子標(biāo)記篩選出了新的長粒株系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)水稻粒長改良的研究主要是以導(dǎo)入gs3基因?yàn)橹?，且報道較少?！緮M解決的問題】以秈稻中間材料R855302作為長粒gs3基因的供體親本，以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗稻瘟病、短?；謴?fù)系R33947為受體親本，利用gs3基因的特異分子標(biāo)記開展MAS育種研究，以期育成長粒、千粒重較高的新恢復(fù)系，為進(jìn)一步培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)兼顧的雜交水稻新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

受體親本為R33947，其株葉型較優(yōu)、稻瘟病抗性強(qiáng)，但籽粒短小、千粒重較低，配制的雜交組合產(chǎn)量優(yōu)勢不突出。供體親本為長粒型中間材料R855302，其來源是川香29B/成恢3203//成恢3203///成恢3203。這兩個材料均為本團(tuán)隊自主育成。

1.2 gs3基因內(nèi)分子標(biāo)記輔助選擇及RICE6K育種芯片分析

采用CTAB 法[15]提取水稻幼嫩葉片總DNA。gs3基因內(nèi)標(biāo)記RGS1 (F：5’-TCCACCTGCAGA TTTCTTCC-3’；R：5’-GCTGGTCTTGCACATCTCTCT-3’)[16]由北京迪納興科生物科技有限公司合成。 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照李浩杰等(2004)方法[17]。采用RICE6K育種芯片(中國種子集團(tuán)有限公司)進(jìn)行遺傳背景分析。該芯片包含5102個SNP標(biāo)記和InDel標(biāo)記，其中4500個標(biāo)記能被穩(wěn)定檢出。這些標(biāo)記分布在水稻12條染色體上，平均標(biāo)記距離為1 Mb[18]。

1.3 目的基因與表型選擇

用R33947與R855302雜交，并用R33947回交1次。BC1F1單株用分子標(biāo)記鑒定gs3基因型，選擇該位點(diǎn)為雜合的單株，收獲自交種子。在BC1F2群體中選擇長粒型單株。以后各世代結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇和表型觀察，選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良、田間稻瘟病抗性強(qiáng)和低堊白的長粒型優(yōu)良單株或株系。從BC1F5代開始，進(jìn)行配合力測定，觀察產(chǎn)量雜種優(yōu)勢。對中選株系進(jìn)行考種和遺傳背景分析，并與優(yōu)質(zhì)香稻不育系川康606測交，培育米質(zhì)優(yōu)良和產(chǎn)量配合力高的新恢復(fù)系。選育流程見圖1。

1.4 田間種植和性狀考察

1.4.1 田間種植 恢復(fù)系材料，每個小區(qū)種植4行，每行10株，單本插，間距16.7 cm×23.3 cm。記載生育期和整齊度。成熟時，結(jié)合分子標(biāo)記鑒定結(jié)果和表型，選擇優(yōu)良單株或株系。在BC1F7世代，每個小區(qū)3次重復(fù)，各5行，每行10株，單本插，間距16.7 cm×23.3 cm，以R33947為對照。

測交組合，每個小區(qū)種植8行，每行10株，單本插，間距16.7 cm×26.7 cm，以F優(yōu)498為對照。

1.4.2 性狀考察 對改良的長粒型株系和短粒型受體恢復(fù)系R33947進(jìn)行性狀考察，包括：株高 (Plant height, PH)、單株有效穗數(shù) (Number of panicles per plant, NP)、每穗實(shí)粒數(shù) (Number of filled grains per panicle, NFG)、每穗總粒數(shù) (Total number of spikelets per panicle, TNS)、結(jié)實(shí)率 (Seed setting ratio, SSR)、千粒重 (1000-grain weight, TGW)、單株產(chǎn)量 (Grain yield per plant, GY)、粒長 (Grain length, GL)、粒寬 (Grain width, GW)、長寬比 (Ratio of length and width, L/W)、堊白粒率 (Chalky grain rate, CGR)、堊白度 (Chalkiness degree, CD)。

對測交組合測定產(chǎn)量雜種優(yōu)勢。2018年川康優(yōu)637(川康606A/成恢637)參加長江上游科企聯(lián)合體區(qū)域試驗(yàn)，有關(guān)試驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)的收集按照區(qū)試要求進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)收集和分析

考種數(shù)據(jù)的收集和整理使用WPS表格，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 長粒型改良系的培育

2012年冬季，海南種植R33947與R855302的BC1F1群體，在苗期用gs3基因的功能標(biāo)記RGS1進(jìn)行分析，共有21個單株為雜合基因型。2013年夏季，在成都種植21個BC1F2群體，田間收獲籽粒較長、株型較好的單株，并調(diào)查各單株的堊白粒率和堊白度，共保留72個低堊白單株。從BC1F3代起，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇、田間稻瘟病抗性鑒定和農(nóng)藝性狀觀察，選擇長粒型優(yōu)良單株；至BC1F5代，中選99個株系。在配合力測定的基礎(chǔ)上，于2015年獲得4個性狀穩(wěn)定的長粒型優(yōu)良株系，分別命名為RGL1、RGL2、RGL3和RGL4，其gs3基因型與長粒供體親本R855302相同(圖2)，籽粒長度顯著大于短粒受體親本R33947(圖3)。

圖1 長粒型恢復(fù)系成恢637的選育流程Fig.1 Breeding procedure of the restorer line Chenghui 637 with long grain

2.2 改良系與親本的籽粒和堊白性狀比較

4個改良系的粒長為10.15～10.39 mm，平均比短粒親本R33947增加粒長25.61 %，達(dá)極顯著水平，與供體親本R855302差異不顯著；粒寬為2.69～2.80 mm，顯著小于親本R333947的3.08 mm；長寬比為3.81～3.86，平均比受體親本R33947增加43.89 %，達(dá)極顯著水平；4個株系之間在粒寬、粒長和長寬比性狀上的差異不顯著(表1)。

“M”為DL2000，“1”和“6”為短粒對照R33947，“7”為長粒對照R855302， “2”、“3”、“4”、“5”為改良系RGL1、RGL2、RGL3和RGL4‘M’ is DL2000; ‘1’ and ‘6’ are R33947 with shorter grain; ‘7’ is R855302 with longer grain; ‘2’, ‘3’,‘4’ and ’5’ indicated the improved lines named as RGL1, RGL2, RGL3 and RGL4, respectively圖2 利用gs3基因內(nèi)標(biāo)記RGS1對4個改良系和親本的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR analysis of gs3 with marker RGS1 in four improved lines and the parental lines

4個改良系的堊白粒率極顯著低于供體親本R855302。RGL1、RGL3和RGL4的堊白粒率較低，與受體親本R33947沒有顯著差異。其中，RGL4的堊白粒率較低，為1.63 %。在堊白度方面，4個改良系極顯著低于供體親本R855302，然而高于受體親本R33947。其中，RGL4的堊白度較低，與受體親本R33947的差異不顯著；另外3個改良系的堊白度有所增加，與受體親本R33947的差異達(dá)顯著水平，其中RGL3較高，達(dá)1.58，且與RGL1和RGL2的差異達(dá)顯著水平(表1)。

2.3 改良系與親本的主要產(chǎn)量性狀比較

經(jīng)多重比較(表2)發(fā)現(xiàn)，RGL1、RGL2和RGL3的株高較高，它們與RGL4和雙親的差異達(dá)顯著水平。RGL1的單株有效穗數(shù)較多，RGL4個改良系的單株有效穗數(shù)較少，它們之間的差異大極顯著水平，且與其他2個改良系和雙親有顯著差異。4個改良系的千粒重為26.05～27.04 g，平均比比供體親本R855302低12.56 %，但是比短粒親本R33947增加26.27 %，差異達(dá)極顯著水平。 在每穗總粒數(shù)和每穗實(shí)粒數(shù)方面，4個改良系都顯著低于受體親本R33947，顯著高于供體親本R855302，且它們之間有顯著差異。RGL1的每穗總粒數(shù)和每穗實(shí)粒數(shù)較低，且與其它3個改良系的差異達(dá)極顯著水平。4個改良系的結(jié)實(shí)率都顯著高于受體親本R33947，顯著低于供體親本R855302，且改良系之間的差異也達(dá)到顯著水平。從單株產(chǎn)量來看，RGL1、RGL2和RGL3的單株產(chǎn)量顯著高于受體親本R33947，其中RGL2的最高，達(dá)34.27 g，比短粒親本R33947增產(chǎn)30.58 %；RGL3為29.79 g，比對照增產(chǎn)14.44 %；RGL4的單株產(chǎn)量最低，為24.45 g，減產(chǎn)6.67 %。

表1 改良系和親本的粒形和堊白性狀

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) ；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01) 。下同。

Note: Different lower case letters in each column indicated significant differences (P<0.05). Different capital letters indicated extremely significant differences (P<0.01).The same as below.

表2 改良系和親本的主要產(chǎn)量性狀表現(xiàn)

2.4 長粒改良系的育種芯片分析結(jié)果

中國種子集團(tuán)有限公司生命科學(xué)技術(shù)中心提供的RICE6K育種芯片數(shù)據(jù)顯示，4個改良系的分析結(jié)果相同，它們之間沒有差異位點(diǎn)。這可能是因?yàn)樵贐C1F5世代來自于同一個株系。育種芯片共檢測到4402個SNP位點(diǎn)，其中與短粒親本R33947帶型一致的標(biāo)記數(shù)是3704個，占檢測位點(diǎn)數(shù)的84.14 %。改良系有695個位點(diǎn)來自于與長粒親本R855302。

圖3 改良系與親本的粒型比較Fig.3 Comparison of grain type among the improved lines and parents

線條表示SNP位點(diǎn)為純合供體親本R855302片段，白色區(qū)域表示SNP位點(diǎn)為純合受體親本R33947片段The lines represents the SNP loci with homozygous genotypes as the donor parent R855302, the white boxes indicate the loci with the same genotypes as the recurrent parent R33947圖4 長粒型改良系育種芯片分析Fig.4 Analysis of four long-grain improved lines using RICE6K array

表3 川康優(yōu)637和F優(yōu)498的產(chǎn)量及品質(zhì)性狀比較

它們主要集中在第2、3、6、7、8和12染色體上(圖4)。

2.5 優(yōu)良雜交組合川康優(yōu)637的產(chǎn)量及品質(zhì)測試

2016年成都，根據(jù)田間觀察，RGL1和RGL3與優(yōu)質(zhì)香稻不育系川康606A的雜交組合表現(xiàn)較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。測產(chǎn)分析表明，雜交組合川康606A/RGL3的產(chǎn)量較高(數(shù)據(jù)略)。隨后將長粒型株系RGL3定名為成恢637，并將該組合定名為川康優(yōu)637。2017年，川康優(yōu)637參加多點(diǎn)試驗(yàn)，表現(xiàn)優(yōu)良。2018年參加長江上游科企聯(lián)合體中秈遲熟組區(qū)域試驗(yàn)。結(jié)果表明，川康優(yōu)637的全生育期比對照F優(yōu)498長0.9 d，株高矮4.3 cm；有效穗數(shù)達(dá)240萬穗/hm2，比對照高14.29 %。川康優(yōu)637的產(chǎn)量達(dá)到9.61 t/hm2，比對照增產(chǎn)4.7 %(表3)。

川康優(yōu)637米質(zhì)優(yōu)良。在外觀品質(zhì)性狀方面，川康優(yōu)637的粒長和長寬比分別為7.5 mm和3.3，分別比對照F優(yōu)498增加5.63 %和13.79 %；堊白粒率和堊白度分別為17.7 %和1.7，比對照降低150.28 %和247.06 %；川康優(yōu)637的透明度為1.0，比對照提高100 %。在加工品質(zhì)性狀方面，川康優(yōu)637的糙米率和精米率分別是80.3 %和70.6 %，略低于對照F優(yōu)498，但是整精米率比對照增加5.07 %。在食味品質(zhì)性狀方面，川康優(yōu)637的堿消值為6.7，比對照高9.84 %；膠稠度略短于對照，直鏈淀粉含量為17.3 %，比對照低28.32 %。與部頒優(yōu)質(zhì)米標(biāo)準(zhǔn)對比，川康優(yōu)637達(dá)到“優(yōu) 2”等級。此外，川康優(yōu)637在四川和貴州點(diǎn)穗頸瘟最高級為5級，而對照F優(yōu)498為9級、重感稻瘟病。

綜上所述，川康優(yōu)637是一個達(dá)到部頒2級優(yōu)質(zhì)米、豐產(chǎn)性好、抗病性強(qiáng)的雜交水稻新品種。

3 討 論

隨著人們生活的改善，消費(fèi)者對秈稻米質(zhì)有了更高的要求。主要需求是稻米細(xì)長、透明度好、口感軟硬適中，香氣濃郁等。由于歷史上糧食短缺的原因，我國水稻育種長期重視豐產(chǎn)性改良，而對優(yōu)質(zhì)育種關(guān)注不夠。至今，雜交水稻給消費(fèi)者的印象是產(chǎn)量很高，但品質(zhì)一般。隨著水稻分子技術(shù)的進(jìn)步，水稻粒長、粒寬和香味等品質(zhì)性狀基因已先后被克隆[11, 20-22]。不少研究者利用功能標(biāo)記，通過分子輔助選擇方法改良水稻的品質(zhì)性狀，并獲得很好的效果[12-14]。在粒長改良方面，主要利用粒長主效基因gs3。2010年，楊梯豐等[12]首次實(shí)現(xiàn)了利用gs3對華粳秈74谷粒長性狀進(jìn)行定向改良，獲得了一批谷粒長達(dá)到 9.51～9.67 mm的長粒形品系。2015年，謝坤利用gs3和qSS7定向改良Ⅱ-32B的粒長，獲得了21個粒長在9.11～10.87 mm的長粒株系[14]。本研究利用來自中間材料R855302的gs3基因?qū)攘ｉL性狀進(jìn)行定向改良，結(jié)合低堊白、優(yōu)良株型和稻瘟病抗性選擇，育成了4個優(yōu)良的長粒株系。這些研究結(jié)果表明，gs3在不同遺傳背景中對粒長的基因效應(yīng)表現(xiàn)穩(wěn)定，適用于分子設(shè)計育種。

Fan C.C.等(2006)克隆了gs3基因，并證明其對粒長是主效基因，同時對粒重有影響[11]。謝坤的研究指出，當(dāng)長粒gs3和寬粒GW28組合時，稻谷的千粒重較高[14]。王建等(2017)分析了粒型基因GW2和gs3在不同背景下對粒重的影響。結(jié)果表明，不同遺傳背景中GW2和gs3的基因效應(yīng)有差異，但同一背景下GW2對籽粒重量的貢獻(xiàn)大于gs3[23]。在本研究中，4個改良株系的粒長和千粒重都顯著優(yōu)于短粒親本R33947。這說明gs3能同時改良粒長和粒重。由于穗數(shù)、結(jié)實(shí)率等性狀受其它基因調(diào)控，加之本研究只用短粒親本回交了一次，所以盡管粒重都顯著增加，但RGL4株系的單株產(chǎn)量仍然低于短粒親本R33947。這一結(jié)果說明，在自交后代中既要關(guān)注目標(biāo)性狀的改良，又要注重綜合性狀的選擇，才能進(jìn)一步提高水稻單株和群體的產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

通過常規(guī)的回交選育、分子標(biāo)記輔助選擇和抗病鑒定，結(jié)合優(yōu)良形態(tài)選擇的方法，篩選獲得4份gs3純合的優(yōu)質(zhì)抗病改良系，為選育新的優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系提供種質(zhì)資源。育成優(yōu)良恢復(fù)系成恢637，其與優(yōu)質(zhì)香稻不育系川康606A配制的新組合“川康優(yōu)637”具有品質(zhì)優(yōu)良、豐產(chǎn)性好、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)。