， ，

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

大豆為豆科植物，因其種皮顏色不同分為黃大豆和黑大豆，黑大豆可藥食兩用，在我國由南到北28個(gè)省市有廣泛的分布[1]。黑大豆種子中蛋白質(zhì)含量豐富，占比可達(dá)36%～40%，并居豆類之首[2-3]。有關(guān)黑大豆種子球蛋白的提取研究目前所見報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)對黑大豆種子球蛋白的提取及電泳體系進(jìn)行了研究，旨在建立黑大豆種子球蛋白提取的簡單易行的優(yōu)化體系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在市場上購買黑大豆種子并研磨成粉末用于實(shí)驗(yàn)。

表2 實(shí)驗(yàn)安排

溫度(℃)405060試管號147258369固液比1∶71∶101∶131∶71∶101∶131∶71∶101∶13時(shí)間(h)123231312提取液濃度(%)ABCBCACAB

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑大豆種子球蛋白的提取

采用三水平四因素的正交試驗(yàn)，如表1所示。提取液分為3組，每組分為3個(gè)濃度梯度，用A、B、C表示。第一組為A：0.5%NaCl、B:1.0%NaCl、C：1.5%NaCl；第二組為A：2.0%NaCl、B：2.5%NaCl、C：3.0%NaCl；第三組為A：3.5%NaCl、B：4.0%NaCl、C：4.5%NaCl。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

因素水平固液比(g/mL)溫度(℃)時(shí)間(h)提取液濃度(%)11∶7401A21∶10502B31∶13603C

按表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，水浴結(jié)束后將試管內(nèi)的溶液移至離心管中，6 000 r/min離心15 min棄去沉淀，測定上清液中黑大豆球蛋白含量。

1.2.2 電泳實(shí)驗(yàn)

采用SDS-PAGE法進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑大豆球蛋白的提取及分析

圖1為第一組提取液(NaCl濃度分別為A：0.5%、B:1.0%、C：1.5%)提取黑大豆種子球蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過極差計(jì)算可以看出，4種因素對黑大豆球蛋白提取的影響有所不同，其中固液比對提取影響較大，極差為0.354，影響較小的是提取液的濃度，極差為0.055。

圖1 第一組提取液提取黑大豆球蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2為第二組提取液(A：2.0%NaCl、B：2.5%NaCl、C：3.0%NaCl)提取黑大豆種子球蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，4種因素固液比、溫度、時(shí)間和提取液濃度對提取體系影響的極差相應(yīng)為0.169、0.151、0.089和0.045，與第1個(gè)提取體系一致的是固液比對提取影響較大，影響最小的因素是提取液濃度。

圖2 第二組提取液提取黑大豆球蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3為第三組提取體系(A：3.5%NaCl、B：4.0%NaCl、C：4.5%NaCl)對黑大豆種子球蛋白提取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過極差分析可見，對提取影響較大的因素是固液比，極差是0.295，影響較小的因素是溫度極差為0.023。

圖3 第三組提取液提取黑大豆球蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 SDS-PAGE分析

圖4～圖9分別顯示了3個(gè)提取體系所提取的黑大豆種子球蛋白SDS-PAGE圖譜，從圖譜可以看出，不同的提取體系相同的上樣量及同一提取體系不同的上樣量，所得到的電泳圖譜的電泳條帶數(shù)量和清晰度均出現(xiàn)了不同。對于同一個(gè)提取體系均表現(xiàn)出10μL上樣量的電泳條代數(shù)多于7μL上樣量的電泳條帶數(shù)，并有較好的清晰度。而在相同上樣量的情況下，第三組提取液所提取的黑大豆球蛋白的電泳圖譜條帶數(shù)量較多且較清晰。

圖4 第一組10 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖5 第一組7 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖6 第二組10 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖7 第二組7 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖8 第三組10 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖9 第三組7 μL上樣混合液1-9號管電泳圖譜

3 結(jié) 論

不同提取條件對黑大豆種子球蛋白提取有不同影響，本研究所設(shè)置的不同提取體系中對提取影響最大的因素是一致的，均為固液比，但影響最小的因素有所不同，第一組和第二組為提取液濃度，第三組為溫度。在本實(shí)驗(yàn)的處理體系中，對于黑大豆球蛋白SDS-PAGE最優(yōu)化的體系是：提取液濃度為4.0%NaCl、固液比為1∶7、提取溫度為50 ℃、提取時(shí)間為2 h、上樣量為10μL的電泳體系。

參考文獻(xiàn)：

[1]袁利鵬,楊君,賴來展,等.黑大豆?fàn)I養(yǎng)功能及開發(fā)豆皮色素的探討[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2009,160(1):49-52.

[2]龍偉,靳瑾,沈秀,等.新體系評價(jià)東北黑大豆的營養(yǎng)健康功效[J].大豆科學(xué),2014,3(6):915-919.

[3]江甜,何毅,祝振洲,等.黑豆蛋白的分級提取及黑豆花色苷的成分鑒定[J].食品科學(xué),2017:38(4):217-221.

[4]張艷馥,任艷波,沙偉,等.大豆種子醇溶蛋白的提取及 SDS-PAGE分析[J].種子,2015,34(11):41-43.