郭頌欣，何士俊，黃翠紅，姚新剛，劉叔文

(南方醫(yī)科大學藥學院，廣東省新藥篩選重點實驗室，廣州市新發(fā)病毒防治藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510515)

登革病毒(dengue virus，DENV)屬黃病毒科，黃病毒屬(Flaviviridae)，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒[1]。隨著城市化進程和全球氣候變暖，登革病毒已成為當今世界上分布最廣的蟲媒病毒，該病毒具有4個血清型，主要流行在亞州、非州及南美州的熱帶和亞熱帶地區(qū)[2-3]。感染該病毒后，引起機體出現(xiàn)一系列自限性發(fā)熱性疾病，如發(fā)熱等，嚴重時為致命的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)[1]。據(jù)估計，全球范圍內(nèi)每年約有5 000萬到1億登革熱感染病例，50萬例登革出血熱，其中25 000人不治而亡[1]。近年來，登革熱病例正在迅猛增加，這種致命的傳染病已威脅到全球三分之一人口的健康安全[1]。然而遺憾的是，至今沒有安全有效的用于治療和預(yù)防登革病毒感染疾病的藥物，因此，急需尋找和開發(fā)抗登革病毒藥物。

登革病毒基因組是全長10.3 kb的單股正鏈RNA，翻譯表達為1條多蛋白前體,隨后被宿主蛋白酶和病毒的NS2B/NS3蛋白酶切割為10種成熟的蛋白，包括3種與病毒血清型區(qū)分和參與病毒吸附進入有關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白(C、PrM、E)，以及7種與免疫逃避和病毒復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[4]。NS5是病毒最大的蛋白，相對分子質(zhì)量為104 ku，約含900個氨基酸，在4種基因型中結(jié)構(gòu)最為保守[5]。其N端具有SAM依賴的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，參與病毒基因組RNA的5’端加帽，C端具有RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)活性和核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶活性[5]。NS5的RdRp在病毒復(fù)制酶系統(tǒng)中起不可替代的作用，在病毒復(fù)制時，RdRp協(xié)助負鏈RNA的從頭合成，隨后以該負鏈RNA為模板復(fù)制產(chǎn)生病毒基因組[5]。本研究基于SPR高通量篩選技術(shù)，篩選與NS5 RdRp結(jié)合的小分子多取代二氫吡咯烷酮衍生物，通過細胞實驗驗證其抗登革病毒作用，并對其抗病毒的機制進行初步探討，研究結(jié)果將為開發(fā)有效的防治登革病毒藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與病毒 DENV2病毒新幾內(nèi)亞株，由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學院陳曉光教授提供。BHK-21細胞由本科室保存， C6/36細胞由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學院提供，培養(yǎng)方法參照ATCC細胞庫指示。

1.1.2試劑 His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂(上海翊圣生物科技有限公司)；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導劑、噻唑藍(MTT)、利巴韋林(ribavirin)，均購自Sigma公司；咪唑(imidazole，廣州浩瑪生物科技有限公司)；乳酸脫氫酶試劑盒(lactate dehydrogenase, LDH, 碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑(Ambion公司)；5×PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa公司)；GoTaq? qPCR Master Mix (Promega公司)；E抗體(dengue virus envelope protein antibody，GeneTex公司)；NS1抗體(dengue virus NS1 glycoprotein antibody，Abcam公司)。

1.1.3儀器 Genios Pro型Tecan酶標儀(Tecan公司)；Milli-Q超純水機(Millipore公司)；7500型實時熒光定量PCR儀(ABI公司)；FluorChem R多功能成像分析系統(tǒng)(Protein Simple公司)；倒置激光共聚焦顯微鏡 (ZEISS公司)；生物分子相互作用分析儀(Plex Array HT公司)。

1.2方法

1.2.1登革病毒NS5 RdRp的表達與純化 將NS5 RdRp表達基因克隆于pET15b His標簽載體上，在BL21上進行表達，37 ℃培養(yǎng)至OD值 0.5～0.6，加入100 mg·L-1IPTG誘導劑18 ℃誘導16 h。細菌超聲破菌30 min，收集含有NS5 RdRp的上清。NS5 RdRp蛋白用鎳柱親和層析法及咪唑梯度洗脫純化，各組分蛋白在SDS-聚丙烯酰胺電泳分離后，用考馬斯亮藍染色液染色。收集含雜質(zhì)較少的組分裝入透析袋，在沒有咪唑的蛋白緩沖溶液中4 ℃透析24 h，超濾管濃縮，分子篩進一步純化后，-80 ℃冰箱保存。

1.2.2LDH釋放含量檢測細胞活性 在細胞培養(yǎng)板中接種處于對數(shù)生長期的BHK-21細胞，1×108·L-1。加入病毒液，37 ℃感染1 h。藥物處理組分別加入200 μL含2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至指定濃度的Z1，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。96 h后，待病毒組細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變，收集上清，測上清中細胞釋放的LDH含量。抑制率/%=(A病毒組-A實驗組)/(A病毒組-A空白對照組)×100%。

1.2.3蛋白免疫印跡檢測病毒蛋白含量 按上述設(shè)置陽性藥物組、病毒組、空白對照組、藥物處理組，48 h后，RIPA裂解液收取細胞總蛋白。在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗以及二抗，顯影、定影。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測病毒mRNA水平 在加入藥物處理48 h后，提取各組細胞總mRNA。隨后參照TaKaRa說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。各引物序列見Tab 1。根據(jù)各樣品的CT值，運用2-ΔΔCт法算出各樣品相對于對照組的mRNA水平。

Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.5激光共聚焦顯微鏡觀察病毒蛋白的分布與含量 BHK-21細胞感染病毒及化合物處理如上述，在病毒感染后的48 h，依次加入3 g·L-1BSA配制的登革病毒包膜蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白1一抗、二抗，在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.6空斑實驗 將C6/36細胞接種至24孔培養(yǎng)板，然后將不同稀釋度的病毒稀釋液分別加入24孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，每個稀釋度2個復(fù)孔。同時設(shè)陰性及陽性對照。將24孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附1 h。然后吸出病毒液，每孔加入500 μL 2.4 g·L-1甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)基。培養(yǎng)4～6 d后，至病毒空斑明顯時，固定，結(jié)晶紫染色，計算空斑的數(shù)量[6]。

1.2.7表面等離子共振法檢測Z1與NS5蛋白相互作用 Z1打印在3D光交聯(lián)芯片上，芯片進行真空干燥處理，在光交聯(lián)儀器進行光交聯(lián)反應(yīng)。NS5 RdRp蛋白樣品濃度為1 g·L-1，通過加入相應(yīng)量的蛋白緩沖溶液稀釋為3個梯度濃度：400、800、1 600 nmol·L-1。依次加載不同濃度梯度的NS5蛋白樣品各650 μL，流速為2 μL·s-1，結(jié)合反應(yīng)溫度為16 ℃，結(jié)合時間為300 s，解離時間為300 s。隨后，用Glycine-HCl(pH=2.0)溶液作為重生液(用超純水配制)，進行重生。

1.2.8統(tǒng)計學分析 運用Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用Student’st檢驗，多組比較采用單因素One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1小分子化合物Z1與DENV2NS5RdRp相結(jié)合我們構(gòu)建了帶有His標簽的NS5 RdRp蛋白(273-900)表達純化體系，得到純度達到90%以上的蛋白NS5 RdRp，其考馬斯亮藍PAGE圖如Fig 1A所示。運用表面等離子技術(shù)(SPR)高通量篩選小分子化合物庫，發(fā)現(xiàn)小分子化合物Z1(Fig 1B)與NS5 RdRp結(jié)構(gòu)域具有明顯的結(jié)合活性(Fig 1C)。用軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)擬合，得到ka=7.44×103Ls·mol-1，kd=7.17×10-4·s-1，KD=9.63×10-8mol·L-1，表明Z1和NS5有較強親和性，結(jié)果顯示Z1是一種新型的DENV2 NS5 RdRp小分子配體。

Fig 1 Affinity between Z1 and NS5 RdRp

A: Coomassie brilliant blue staining map of NS5 RdRp purification. M: Protein marker. The arrow indicates the NS5 RdRp protein about 70 KD; B: Structure of Z1; C: SPR-based binding assay of DENV-2 NS5 with Z1.

2.2Z1抑制DENV2誘導的細胞病變和細胞死亡MTT結(jié)果顯示，Z1在1.25、2.5、5、10 μmol·L-1濃度下，對BHK-21細胞毒性較低(Fig 2I)，使用上述濃度可排除其細胞毒性對活性檢測的影響。DENV2感染后，在胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域內(nèi)引起細胞骨架和膜室的廣泛重組，形成 “病毒工廠”以生產(chǎn)子代病毒[7]，導致細胞出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect , CPE)。BHK-21細胞感染DENV2后，在d 4出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)，表現(xiàn)為有退行性的形態(tài)學改變，細胞間緊密連接降低使細胞脫離，膜的降解，最終死亡[8-9](Fig 2B)。而在感染后給予廣譜抗病毒藥利巴韋林(ribavirin, 40 μmol·L-1)，在d 4時細胞形態(tài)正常(Fig 2C)。而Z1處理后，細胞病變呈濃度依賴性減弱，至1.25 μmol·L-1時活性消失，表明化合物Z1具有濃度依賴抑制登革病毒感染的活性(Fig 2D-2H)。隨后以LDH的含量作為Z1抑制DENV2活性的定量描述，發(fā)現(xiàn)感染DENV2后的BHK-21 LDH釋放量明顯升高，而Z1對DENV2引起的LDH升高有濃度依賴的抑制作用，其半數(shù)有效濃度(EC50)為4.75 μmol·L-1(Fig 2J), 進一步表明Z1能有效抑制DENV2導致的BHK-21死亡，可保護感染的宿主細胞。接著，我們通過經(jīng)典的空斑實驗，進一步檢測化合物Z1對病毒子代顆粒產(chǎn)生的抑制效果。發(fā)現(xiàn)2.5、5、10 μmol·L-1的Z1對空斑形成的抑制率分別為2.04%、9.39%、88.16%，說明Z1濃度依賴地抑制子代病毒的產(chǎn)生(Fig 2K)。以上實驗表明，Z1具有抗登革病毒感染和抑制病毒增殖活性。

2.3Z1抑制DENV2的RNA合成實時熒光定量PCR檢測病毒E和NS1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)5、10 μmol·L-1Z1濃度依賴地降低細胞內(nèi)DENV2 E蛋白和NS1的RNA水平(Fig 3A)。正鏈RNA病毒DENV2在復(fù)制時，會產(chǎn)生能被J2抗體識別的復(fù)制中間體dsRNA[10]。通過J2抗體對dsRNA進行標記，激光共聚焦實驗顯示，明亮綠色熒光聚集在胞質(zhì)呈點狀分布，表明在這些區(qū)域存在大量的病毒復(fù)制中間體dsRNA。而在5 μmol·L-1Z1處理下，DENV2的復(fù)制中間體dsRNA含量明顯減少(Fig 3B)，表明Z1抑制病毒RNA復(fù)制合成，即Z1作用于NS5的RdRp結(jié)構(gòu)域，并抑制其RNA聚合酶的活性，從而抑制RNA的復(fù)制。

2.4Z1抑制DENV2的蛋白合成在感染DENV2 48 h后，Western blot檢測細胞內(nèi)病毒包膜蛋白含量，發(fā)現(xiàn)在2.5、5、10 μmol·L-1Z1處理后，呈濃度依賴減少，表明病毒包膜蛋白的合成受到抑制(Fig 4A)。另外，激光共聚焦顯微鏡600倍鏡下，在感染DENV2的BHK-21細胞內(nèi)，病毒E和NS1在胞質(zhì)大量分布，表明DENV2在胞質(zhì)進行活躍蛋白合成，這與前人研究發(fā)現(xiàn)DENV2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成蛋白合成實現(xiàn)增殖過程一致。而在5 μmol·L-1化合物Z1處理下，病毒包膜蛋白E(Fig 4B)和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(Fig 4C)在胞質(zhì)的累積減少，證明Z1影響病毒蛋白合成。

2.5Z1阻止DENV2的早期復(fù)制階段為確認小分子化合物Z1的抑制作用是作用于DENV2的進入，還是進入后階段，我們分別在DENV2感染前、感染后給予5、10 μmol·L-1Z1處理。結(jié)果表明，當用以下兩種方式處理時，即DENV2感染前用Z1處理細胞在感染時撤去，以及在Z1存在下感染DENV2，Z1的病毒RNA合成抑制活性消失，抑制子代病毒釋放活性消失，且失去了對DENV2感染細胞細的保護作用；只有在DENV2感染后，Z1持續(xù)處理細胞能抑制DENV2引起的細胞死亡，抑制病毒RNA合成，以及抑制子代病毒釋放(Fig 5)。表明Z1只對感染了DENV2的BHK-21細胞有保護作用，該結(jié)果表明Z1作用于DENV2的早期復(fù)制階段。

Fig 2 Z1 protected DENV2-infected cells from death in cell-based assay

A-H: Morphological changes of Z1 treated and DENV2 infected BHK-21 cells at 96hpi; I: Cytotoxicity of BHK-21 in Z1 by MTT assay; J: The effect of Z1 on LDH released by DENV2 infected BHK-21 cells by LDH assay at 96hpi; K: Effect of Z1 on DENV2 production by plaque assay at 48hpi.**P<0.01vsDENV2 infected group without treatment.

3 討論

登革疫情日益嚴峻，目前仍無有效的藥物，因此，抗登革病毒藥物的研發(fā)迫在眉睫[11]。在登革感染病例中，二次感染異型病毒產(chǎn)生的抗體依賴感染增強作用，使患者更容易出現(xiàn)致死率更高的引起出血和休克的DHF和DSS，于是抗登革藥物的研發(fā)應(yīng)傾向于能廣泛抑制DENV的4種血清型[1]。登革病毒NS5是具有多種功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒基因組的復(fù)制中承擔核心作用，針對其結(jié)構(gòu)保守的RdRp結(jié)構(gòu)域設(shè)計的抑制劑可以研發(fā)成為廣譜的抗登革藥物[5]。

Fig 3 Inhibition of compound Z1 on DENV RNA replication

A：The effect of 2.5, 5, 10 μmol·L-1Z1 on E and NS1 mRNA in BHK-21 cells was examined by RT-PCR at 48hpi.**P<0.01vsDENV2 infected group without treatment; B: dsRNA was monitored by laser scanning confocal microscopy in BHK-21 at 48hpi. Arrows indicate the stained dsRNA.

許多有臨床價值如抗炎、抗腫瘤、抗HIV、抗老年癡呆等的化合物都含有吡咯烷酮的母核結(jié)構(gòu)[12-13]。已有文獻報道，這類化合物具有抑制caspase-3酶活化，抗凋亡的活性[14]。運用我們科室已驗證的NS5 RdRp蛋白表達純化平臺，結(jié)合SPR技術(shù)，尋找能與NS5 RdRp結(jié)合并能抑制其活性的含有吡咯烷酮母核結(jié)構(gòu)的小分子化合物，最終發(fā)現(xiàn)，這類化合物中的Z1與 NS5 RdRp有明顯結(jié)合能力，具有潛在的抗登革病毒作用。CPE和空斑形成實驗是驗證藥物抗病毒活性的金標準[1]。因此，在細胞水平上，我們通過3種細胞實驗驗證候選化合物Z1的抗病毒活性。CPE抑制實驗從細胞感染DENV2后的CPE出發(fā)，具有抗病毒活性的小分子化合物能抑制病毒增值感染過程，減少病毒載量，從而減輕感染細胞膜結(jié)構(gòu)破壞。LDH實驗中，LDH釋放量是細胞毒性指標，是我們定量化合物抗病毒活性的主要方法?？瞻邔嶒烇@示Z1濃度依賴的登革抑制活性。3種細胞實驗的驗證充分說明了Z1的抗病毒效果。隨后我們發(fā)現(xiàn)，其對HIV病毒和流感病毒并沒有明顯的抑制活性，而對登革其他血清型(DENV1、DENV4)同樣具有抑制活性，很有可能是廣譜的抗登革病毒藥物。既然Z1具有抗病毒活性，又存在NS5 RdRp親和性，那么Z1的抗病毒活性有可能通過抑制RdRp活性實現(xiàn)的。為了驗證這一點，我們以5 μmol·L-1Z1處理細胞進行后續(xù)的實驗，此時Z1具有抗病毒活性，細胞存活率大于84.96%。由于NS5 RdRp在病毒RNA基因組復(fù)制中的關(guān)鍵作用，我們檢測Z1對病毒RNA合成水平，發(fā)現(xiàn)均有濃度依賴的抑制作用，表明Z1通過抑制NS5 RdRp活性，從而抑制RNA復(fù)制。dsRNA在病毒的復(fù)制過程中產(chǎn)生，主要是正鏈RNA復(fù)制時形成的正鏈負鏈RNA產(chǎn)生的雙鏈RNA[15]，當NS5 RdRp的從頭合成活性受到抑制時，dsRNA形成減少，因此Z1再次被證實通過抑制NS5 RdRp，從而抑制RNA復(fù)制，是一種NS5 RdRp小分子抑制劑。隨后，我們檢測Z1處理后DENV2的蛋白合成水平，發(fā)現(xiàn)Z1濃度依賴抑制蛋白合成，證實繼RNA合成減少后，蛋白合成也減少。

Fig 4 The inhibitory effect of compound Z1 onDENV protein synthesis

A: The effect of 2.5, 5, 10 μmol·L-1Z1 on E protein in BHK-21 cells was examined by Western blot at 48hpi; B-C: Infection was monitored by laser scanning confocal microscopy with antibody against the E protein (B) and the NS1 protein (C) in BHK-21 at 48hpi. Arrows indicate the stained E protein (B) and NS1 protein (C).

Fig 5 Compound Z1 inhibited early stage of DENV life cycle

Time course of the effect of 5 or 10 μmol·L-1Z1 on dengue virus infection in BHK-21 cells by LDH assay (A), and plaque assay (B) , RT-PCR (C) at 48hpi. For ‘‘pre’’ conditions, cells were pre-incubated with Z1. For ‘‘co’’ conditions, Z1 was present during the 1-hr incubation of viral inoculum with cells. For ‘‘post’’ conditions, Z1 was added following the initial 1-hr infection and washes. For ‘‘co+post’’ conditions, Z1 was present during and following the 1-hr incubation of viral inoculum with cells.**P<0.01vsDENV2 infected group without treatment.

從頭合成RNA活性受到抑制，對病毒復(fù)制的早期階段產(chǎn)生影響，因此用時間點實驗進一步驗證Z1只有在感染后才具有抗病毒效果，結(jié)果表明，Z1作用于病毒進入后的早期復(fù)制階段。而在感染前處理沒有抑制效果，表明Z1不影響細胞表面吸附的受體，也沒有增強細胞內(nèi)抗病毒相關(guān)的信號，Z1的作用靶點不在細胞上。在感染時處理依然沒有抑制效果，表明Z1對DENV2并沒有殺傷功能，并非作用于病毒結(jié)構(gòu)蛋白，沒有影響DENV2與細胞表面受體的結(jié)合，對DENV2的吸附進入過程沒有影響。再次證實了Z1通過抑制NS5 RdRp活性，從而抑制RNA復(fù)制，抑制病毒增殖的猜想。

因此，在本研究中，Z1在DENV2病毒感染的早期發(fā)揮作用，通過作用于病毒NS5抑制早期病毒的RNA合成，進而降低了病毒自身關(guān)鍵蛋白的合成，達到抗DENV2病毒的效果。這類之前沒報道過的具有NS5RdRp抑制活性的小分子化合物可以作為抗登革病毒先導化合物，通過結(jié)構(gòu)改造進行藥物研發(fā)。而Z1的NS5 RdRp抑制機制如何發(fā)生，仍需進一步探索研究。

(致謝：本實驗在南方醫(yī)科大學藥學院病毒免疫藥物藥理組實驗室完成，病毒相關(guān)實驗在生物安全2級實驗室完成。感謝南方醫(yī)科大學藥學院有機功能材料學科組朱秋華教授提供的化合物。感謝南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學院陳曉光教授提供的登革病毒。)

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