王 煜，李承德,2，曲敬蓉，李 浩，陳博超，聶 克，毛淑梅

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東省重點(diǎn)應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261053；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；3. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510006)

資料顯示，抑郁發(fā)病率逐年增高，目前全球約有15%的人受抑郁困擾[1]。海馬在情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，研究表明，海馬NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活與抑郁的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已證實(shí)，調(diào)節(jié)過(guò)度激活的海馬NF-κB信號(hào)通路可減輕抑郁動(dòng)物模型的抑郁行為[2]。黃芪是一種具有多種藥理活性的中藥，黃芪及其提取物在抑郁的治療中應(yīng)用已久[3-4]。黃芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)是黃芪的提取物之一，具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗氧化等多種活性。研究顯示，APS對(duì)哮喘、糖尿病等多種動(dòng)物模型的NF-κB通路活性具有抑制作用[5]。但APS是否具有抗抑郁作用？對(duì)抑郁機(jī)體海馬NF-κB信號(hào)通路活性有何影響？均未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬就上述問(wèn)題進(jìn)行探索，觀察APS對(duì)大鼠抑郁行為的影響，并探索其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自魯抗集團(tuán)，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK魯20130001。

1.1.2藥品與試劑 APS(惠州市東方植物保健科技有限公司)；NF-κB p65酶聯(lián)免疫試劑盒、p-NF-κB p65、p-IκBα一抗(美國(guó)Cell Signaling公司)；羊抗兔IgG(武漢博士德公司)；TranAMTMNF-κB p65轉(zhuǎn)錄因子分析試劑盒(美國(guó)Active Motif公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美公司)。

1.1.3儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；Morris水迷宮(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)印儀(美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備及藥物干預(yù) 大鼠隨機(jī)分為正常組、抑郁組、APS高、低劑量組，每組10只。抑郁組、APS高、低劑量組大鼠采用經(jīng)典的慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激法(chronic unpredictable mild stress, CUMS)誘導(dǎo)抑郁行為。應(yīng)激因素包括：熱刺激(45℃)，冷水游泳(4℃，5 min)，飲水剝奪(48 h)，飲食剝奪(48 h)，夾尾(180 s)，軀體束縛(1 h)，電擊足底(電壓30 V，120 s，每電擊15 s間歇5 s)，晝夜顛倒，閃光刺激，傾斜鼠籠、潮濕墊料、單籠飼養(yǎng)等居住環(huán)境改變，噪音干擾(2 h)等，共刺激4周。正常組不予以應(yīng)激刺激。APS高、低劑量組大鼠在接受CUMS刺激的同時(shí)，分別給予APS 400、200 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，每日1次，連續(xù)用藥4周；正常組、抑郁組大鼠給予相同體積的生理鹽水。

1.2.2糖水?dāng)z取實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[6]，在測(cè)試前，先給予大鼠1%蔗糖水24 h，訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖的飲水。測(cè)試過(guò)程：大鼠禁水24 h后，單籠飼養(yǎng)，并給予每只大鼠兩瓶外觀相同的飲水，一瓶為純水，一瓶為1%蔗糖水，留置12 h，計(jì)算每瓶液體的攝取量，計(jì)算糖水?dāng)z取量占總液體攝取量的百分比。

1.2.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[6]，將大鼠置于游泳設(shè)備內(nèi)，留置5 min，將大鼠游泳活動(dòng)錄像，并計(jì)數(shù)大鼠在水面靜止不動(dòng)時(shí)間。測(cè)試前1 d，將大鼠置于游泳設(shè)備內(nèi)15 min，訓(xùn)練大鼠適應(yīng)游泳測(cè)試容器。

1.2.4曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[6]，將大鼠置于敞箱中心格內(nèi)(敞箱大小為100 cm×100 cm×80 cm，內(nèi)壁涂為黑色，底面均分為25格)，大鼠在敞箱內(nèi)自由活動(dòng)5 min，錄像并計(jì)數(shù)大鼠水平活動(dòng)及垂直活動(dòng)得分。測(cè)試每只大鼠前，均用乙醇徹底清潔敞箱。

1.2.5Western blot分析 處死大鼠，取新鮮海馬組織，提取總蛋白，上樣40 μg，電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫下用10%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，一抗(p-NF-κB-p65、p-IκBα稀釋度為1 ∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗10 min×3次，二抗(1 ∶10 000)37℃孵育2 h，漂洗3次，顯影，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度/β-actin條帶灰度。

1.2.6NF-κB p65 DNA結(jié)合活性檢測(cè) 取部分海馬組織，提取核蛋白，利用TranAMTMNF-κB p65轉(zhuǎn)錄因子分析試劑盒，檢測(cè)NF-κB p65 DNA結(jié)合活性。

1.2.7ELISA檢測(cè) 將部分海馬組織勻漿，離心后取上清液凍存。采用ELISA法檢測(cè)海馬組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1APS對(duì)大鼠糖水?dāng)z取量的影響如Tab 1所示，與正常組比較，抑郁組大鼠糖水?dāng)z取量明顯減少(P<0.05)。與抑郁組比較，APS低、高劑量組大鼠糖水?dāng)z取量均明顯增增加(P<0.05)，且高劑量組大鼠糖水?dāng)z取量高于低劑量組(P<0.05)。

2.2APS對(duì)大鼠游泳靜止時(shí)間的影響Tab 1結(jié)果顯示，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，與正常組比較，抑郁組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間均較抑郁組明顯縮短(P<0.05)，且高劑量組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間短于低劑量組(P<0.05)。

2.3APS對(duì)大鼠自主活動(dòng)的影響曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中(Tab 1)，與正常組比較，抑郁組大鼠水平活動(dòng)及垂直活動(dòng)得分均明顯減少(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠自主活動(dòng)與抑郁組無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)。

2.4APS對(duì)海馬NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα表達(dá)的影響如Tab 2、Fig 1所示，與正常組比較，抑郁組大鼠海馬NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平明顯升高(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠海馬上述物質(zhì)水平均明顯低于抑郁組(P<0.05)，且高劑量組水平低于低劑量組(P<0.05)。

2.5APS對(duì)海馬NF-κBp65DNA結(jié)合活性的影響如Fig 2所示，與正常組比較，抑郁組大鼠NF-κB p65 DNA結(jié)合活性明顯升高(P<0.05)。APS低、高劑量組大鼠NF-κB p65 DNA結(jié)合活性均明顯低于抑郁組(P<0.05)，且高劑量組NF-κB p65 DNA結(jié)合活性低于低劑量組(P<0.05)。

Tab 1 Effects of APS on behaviors of n=10)

*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model; △P<0.05 vs APS 200 mg·kg-1

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAPS 200 mg·kg-1

Fig 1 Effects of APS on levels of p-NF-κB p65

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAPS 200 mg·kg-1group

2.6APS對(duì)海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響Tab 2結(jié)果顯示，與正常組比較，抑郁組大鼠海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與抑郁組比較，APS低、高劑量組大鼠海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)，且高劑量組上述因子的水平較低劑量組進(jìn)一步下降(P<0.05)。

3 討論

目前常用的治療抑郁的藥物以西藥為主，包括單胺氧化酶抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、雜環(huán)類抗抑郁藥等，其中多數(shù)藥物具有較為突出的不良反應(yīng)。近年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在傳統(tǒng)藥物及其提取物治療抑郁癥方面進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)多種提取物具有抗抑郁作用[7]，為抗抑郁藥的發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了新的途徑。黃芪及其提取物在抑郁的治療中應(yīng)用已久[3-4]。APS是黃芪的提取物之一，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性，但其是否具有抗抑郁活性未見(jiàn)報(bào)道。

Fig 2 Effects of APS on NF-κB p65DNA binding activity n=10)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAPS 200 mg·kg-1group

本研究采用CUMS法制備抑郁大鼠模型，并給予APS治療，治療后對(duì)動(dòng)物行為學(xué)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)被廣泛用于抗抑郁藥物的療效評(píng)價(jià)，其中靜止不動(dòng)時(shí)間代表抑郁動(dòng)物的絕望程度[6]。本研究結(jié)果顯示，CUMS明顯延長(zhǎng)了強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中大鼠的靜止不動(dòng)時(shí)間，而APS明顯縮短了抑郁大鼠的靜止不動(dòng)時(shí)間，說(shuō)明APS對(duì)大鼠具有抗抑郁作用。快感缺乏是抑郁的另一項(xiàng)重要表現(xiàn)，糖水消耗實(shí)驗(yàn)被廣泛用于評(píng)價(jià)抑郁動(dòng)物的快感缺乏程度[6]。本研究結(jié)果顯示，CUMS明顯減少了大鼠的糖水?dāng)z取量，而APS明顯增加了抑郁大鼠的糖水?dāng)z取量，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了APS具有抗抑郁活性。文獻(xiàn)顯示，抑郁動(dòng)物的自主活動(dòng)情況會(huì)影響在抑郁評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中的行為，從而引起實(shí)驗(yàn)誤差[8]。為排除APS可能通過(guò)改變大鼠的自主活動(dòng)而干擾抗抑郁行為的評(píng)價(jià)結(jié)果，本文通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察了APS對(duì)大鼠自主活動(dòng)的影響。結(jié)果顯示，APS未改變大鼠的自主活動(dòng)，該結(jié)果表明APS治療后，大鼠行為學(xué)的改善的確源于APS的抗抑郁作用，而未受大鼠自主活動(dòng)影響。與本研究結(jié)果類似，Liu等[9]研究顯示多種藥物在發(fā)揮抗抑郁作用時(shí)，對(duì)動(dòng)物的自主活動(dòng)無(wú)明顯影響。

目前抑郁癥發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，大量研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與了抑郁的發(fā)生與發(fā)展[2]。NF-κB包括Rel、p65、RelB、p50、p52等5個(gè)亞單位，其中p65在與DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活化中發(fā)揮重要作用。在未激活狀態(tài)時(shí)，NF-κB與IκB結(jié)合形成復(fù)合體，IκB限制了NF-κB向細(xì)胞核移位。在外界某些信號(hào)的刺激下，IκB發(fā)生磷酸化反應(yīng)，IκB轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄疘κB(p-IκB)，從而導(dǎo)致IκB失活，解除了對(duì)NF-κB的抑制，NF-κB進(jìn)入核內(nèi)與特異的κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)其調(diào)控的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。NF-κB在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，近年研究表明抑郁的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。大量文獻(xiàn)顯示，抑郁機(jī)體NF-κB信號(hào)通路被過(guò)度激活，而利用藥物抑制NF-κB的過(guò)度激活，可減輕抑郁模型動(dòng)物的抑郁行為[2,10]。NF-κB對(duì)抑郁的影響可能與其引起的炎癥反應(yīng)，干擾了中樞情緒調(diào)節(jié)有關(guān)。海馬在情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，本研究顯示，CUMS明顯升高了大鼠海馬NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平，并增加了NF-κB p65 DNA結(jié)合活性。其他研究也發(fā)現(xiàn)，CUMS可激活動(dòng)物NF-κB信號(hào)活性[11]，與本研究結(jié)果一致。APS明顯降低了抑郁大鼠海馬NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平，并降低了其N(xiāo)F-κB p65 DNA結(jié)合活性，表明APS可明顯抑制CUMS引起的NF-κB信號(hào)過(guò)度激活。由此推斷，APS的抗抑郁作用可能與抑制大鼠海馬NF-κB活性有關(guān)。與本文APS對(duì)NF-κB的影響類似，另有文獻(xiàn)顯示，APS可抑制哮喘、結(jié)腸炎動(dòng)物模型體內(nèi)NF-κB信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療作用[5,12]。

NF-κB對(duì)機(jī)體的影響是通過(guò)其調(diào)控的下游效應(yīng)分子實(shí)現(xiàn)的[13]。TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子是NF-κB信號(hào)通路的重要下游分子，在炎癥反應(yīng)等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，抑郁患者及抑郁動(dòng)物模型上述細(xì)胞因子均較正常水平明顯升高。TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高與抑郁發(fā)展的關(guān)系已被大量文獻(xiàn)證實(shí)，許多以降低上述因子水平為目標(biāo)的治療方案，均顯示了良好的抗抑郁作用[14]。本研究結(jié)果顯示，CUMS明顯升高了大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。經(jīng)APS干預(yù)后，與對(duì)NF-κB的作用一致，APS明顯降低了抑郁大鼠海馬TNF-α、IL-1β、IL-6水平，這進(jìn)一步驗(yàn)證了APS對(duì)NF-κB信號(hào)通路具有抑制作用。結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，推論APS的抗抑郁作用可能與抑制抑郁大鼠海馬的NF-κB下游細(xì)胞因子有關(guān)。除本研究外，APS的抗炎作用已被大量報(bào)道，資料顯示，APS可明顯降低哮喘、心肌肥厚等動(dòng)物模型的多種細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮治療作用[5,15]。

綜上所述，APS可減輕CMUS誘發(fā)的大鼠抑郁行為，其抗抑郁作用可能與抑制CUMS誘發(fā)的NF-κB激活信號(hào)通路過(guò)度激活有關(guān)。

[致謝：本研究在濰坊醫(yī)學(xué)院應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室(山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)完成。]

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