劉　雙　馬玉俠

山東中儲(chǔ)糧糧油質(zhì)監(jiān)中心　濟(jì)南　250000

小麥的不完善粒包括：蟲(chóng)蝕粒、病斑粒（黑胚粒和赤霉病粒）、破損粒、生芽粒、生霉粒。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，又稱嘔吐毒素DON，主要是由鐮刀菌的某些種產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理活性相似的有毒代謝產(chǎn)物——單端孢霉烯族化合物的一種[1]。DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人和動(dòng)物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。另外，它還常與其它的霉菌毒素如黃曲霉毒素共同污染農(nóng)作物，進(jìn)入人體后可以相互影響。DON屬于劇毒或中等毒物，研究表明，DON可能對(duì)免疫系統(tǒng)有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用[2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)DON可能與人類食道癌、腎病有關(guān)，對(duì)人類及動(dòng)物的健康構(gòu)成威脅。由于DON的危害嚴(yán)重，引起了各國(guó)的普遍重視。谷物及飼料中DON的含量有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)谷物中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1.0mg/kg[3]。

2017年夏季，特別是小麥?zhǔn)崭钋昂?，山東地區(qū)持續(xù)降雨、氣溫多變，多地小麥倒伏現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致收獲小麥水分偏高，此種條件較適合微生物生長(zhǎng)、繁殖。隨后氣溫上升導(dǎo)致絮叨小麥發(fā)熱、生霉、產(chǎn)毒。

相關(guān)研究表明，小麥赤霉病發(fā)病程度和籽粒中嘔吐毒素含量密切相關(guān)，病小麥穗率高則嘔吐毒素含量也高，反之亦然[4]。但小麥的生霉粒與籽粒中嘔吐毒素含量關(guān)系研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用不同生霉粒含量的小麥進(jìn)行嘔吐毒素檢測(cè)，分析小麥生霉粒含量與嘔吐毒素含量的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1　　儀器與試劑

WatersE2695高效液相色譜儀；嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品100μg/mL，購(gòu)于北京華安麥科；甲醇，色譜純，購(gòu)于美國(guó)Honey-well公司；嘔吐毒素免疫親和柱，購(gòu)于北京華安麥科；聚乙二醇，相對(duì)分子量8000；樣品處理及溶劑配制使用實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水。

1.2　　色譜條件

色譜柱：watersC18柱，150 mm×4.6 mm，5μm；流動(dòng)相：甲醇∶水（20∶80）；流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：50μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm。

1.3　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取適量DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100μg/mL）用流動(dòng)相稀釋，配置成200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，4℃保存，有效期7天。在上述色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測(cè)，分別測(cè)定其保留時(shí)間和峰面積。以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖1），并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。測(cè)定結(jié)果表明，嘔吐毒素在200～5000 ng/mL區(qū)間線性關(guān)系良好。

圖1　嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4　　樣品的前處理

將樣品研磨，使其粒度能通過(guò)1mm孔徑的試驗(yàn)篩，不能研成粉末。稱取樣品25 g（準(zhǔn)確到0.1 g）于100mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，用水定容至100mL，混勻，置于搖床上震蕩20min。先以定量濾紙?jiān)僖圆ＡЮw維濾紙過(guò)濾至澄清，收集濾液。

事先將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。將其與玻璃注射器相連，待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，準(zhǔn)確移取2.0mL上述濾液至玻璃注射器中。調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒1滴的流速通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入免疫親和柱中。用5mL PBS緩沖鹽溶液和5mL水先后淋洗免疫親和柱，流速每秒2滴，直至空氣進(jìn)入，并抽干小柱。準(zhǔn)確加入2mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的速度，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)獯抵两?，加?.0mL流動(dòng)相溶解，并過(guò)0.45μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中，以備進(jìn)樣。

1.5　　檢測(cè)的結(jié)果

我們對(duì)生霉粒分別為5%、10%、15%、20%、30%、40%、100%的小麥采用免疫親和柱-高效液相色譜法進(jìn)行嘔吐毒素檢測(cè)，測(cè)定的結(jié)果如圖2所示，圖3列出了其中生霉粒含量40%小麥的嘔吐毒素出峰圖。

圖2　不同生霉粒含量小麥的嘔吐毒素測(cè)定值

測(cè)定的結(jié)果表明不同生霉粒含量的小麥中的嘔吐毒素含量雖然不同，但生霉粒百分比與嘔吐毒素含量不成線性關(guān)系，即生霉粒百分比高的小麥樣品中嘔吐毒素含量不一定高。

圖3　生霉粒含量40%小麥的嘔吐毒素出峰圖

2　分析與討論

2.1　　色譜條件的選擇

因甲醇極性較大，流動(dòng)相中的甲醇和水的比例不同，色譜峰出現(xiàn)的早晚和峰形都會(huì)不同，甲醇比例低出峰延遲，比例高出峰提前。在考慮前期干擾峰和實(shí)驗(yàn)時(shí)間的前提下，選擇甲醇:水為20:80作為流動(dòng)相，比較合適。

2.2　　樣品前處理的影響

在前期處理中，樣品的粉碎程度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響。樣品磨成粉末嘔吐毒素檢測(cè)的數(shù)據(jù)會(huì)低一些，因?yàn)槠渲饕植荚诜N皮表面，小麥本身顆粒較大，加工得越細(xì)表面積越大，導(dǎo)致結(jié)果偏低，同時(shí)，樣品碾磨過(guò)細(xì)也會(huì)造成過(guò)濾困難。

2.3　　結(jié)論

糧食含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是微生物生長(zhǎng)所需的良好基質(zhì)。一旦條件合適，一些微生物就會(huì)生長(zhǎng)、繁殖，導(dǎo)致糧食發(fā)熱、霉變，有的還產(chǎn)生毒素、直接影響儲(chǔ)糧安全。從數(shù)據(jù)上看，小麥的生霉粒含量與嘔吐毒素含量之間沒(méi)有線性關(guān)系，不能說(shuō)明生霉粒含量高的小麥嘔吐毒素含量一定高。

雖然生霉粒含量高的小麥嘔吐毒素不一定高，但是生霉小麥會(huì)對(duì)小麥粉加工、色澤氣味及倉(cāng)儲(chǔ)保管會(huì)造成不利影響，建議收獲、儲(chǔ)存時(shí)盡量在低溫、干燥、厭氧的條件下進(jìn)行，防止小麥霉變。