寧娜　李發(fā)康　李霞　王常清　許圓圓　薛應鈺

摘要：采用菌絲生長速率法，分別測定放線菌ZZ-9菌株對不同溫度及不同藥劑的敏感度，旨在為后期生物制劑的研究提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，放線菌ZZ-9對供試4種殺菌劑均表現(xiàn)出一定的敏感性。其中，對戊唑·丙森鋅最敏感，EC50值為82.99 μg/mL；對辛菌胺醋酸鹽和苯醚甲環(huán)唑次之，EC50值分別為139.51 μg/mL和108.22 μg/mL；而對甲基硫菌靈的敏感性最低，EC50值為267.55 μg/mL。質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，戊唑·丙森鋅、苯醚甲環(huán)唑、辛菌胺醋酸鹽和甲基硫菌靈對該菌株的抑制率分別為46.09%、43.48%、39.13%、27.83%。放線菌ZZ-9菌株在35 ℃下生長最好，15 ℃和45 ℃下生長受到明顯抑制。

關(guān)鍵詞：放線菌；殺菌劑；溫度；敏感性

中圖分類號：R978.1.4 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）11-0041-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.012

Sensitivity of Biocontrol Actinomycete ZZ-9 to 4 Fungicides and Temperatures

NING Na 1， 2， LI Fakang 1， 2， LI Xia 1， 2， WANG Changqing 1， 2， XU Yuanyuan 1， 2， XUE Yingyu 1， 2

（1.College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China； 2. Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province，Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：The mycelial growth rate method was used to determine the sensitivity of actinomycetes ZZ-9 strain to different temperatures and different agents， aiming to provide an important theoretical basis for the later biological preparation research. The results of the drug test showed that actinomycetes ZZ-9 showed some sensitivity to the four fungicides tested. Among them， actinomycetes ZZ-9 was the most sensitive to ethiazole and propionate zinc， with an EC50 value of 82.99 μg/mL； ciprofloxacin acetate and difenoconazole followed by EC50 values of 139.51 μg/mL and 108.22 μg/mL； and the minimum EC50 value for thiophanate-methyl is 267.55 μg/mL. The difenoconazole， ciprofloxacin acetate and thiophanate-methyl were 46.09%， 43.48%， 39.13% and 27.83%， respectively， when the concentration of thiophanate-methyl was 50 μg/mL. The temperature test showed that the strain EZ-9 had the best growth at 35 ℃. Growth was significantly inhibited at 15 ℃ and 45 ℃.

Key words：Actinomycete；Fungicides；Temperature；Sensitivity

中國作為世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國之一，目前在農(nóng)作物病蟲害的防治上主要采取化學防治?；瘜W農(nóng)藥在田間大量應用不僅破壞生態(tài)環(huán)境，而且使農(nóng)副產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留量增加。因此，研發(fā)新型、綠色、安全的生物農(nóng)藥是減少和替代高毒高殘留化學農(nóng)藥的必要途徑[1 ]。

生物農(nóng)藥不僅可以克服化學農(nóng)藥所帶來的缺點，具有無毒、無害、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢，而且滿足人們對綠色食品的需求，同時也為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供可靠保障[2 ]。利用放線菌作為主體的抗生素防治植物病害是植物病理學研究的一個新領(lǐng)域，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中農(nóng)作物病害的重要控制措施[3 ]。展麗然等[4 ]從土壤中分離出1株拮抗放線菌菌株Z-6，相關(guān)試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株不僅對蘋果樹腐爛病菌有較高的抑制作用，而且對番茄灰霉病菌和小麥全蝕病菌等都具有良好的防治效果。李增波等[5 ]從青藏高原的土壤樣品中分離鑒定出1株對多種植物病原真菌和細菌都具有較強的抑制作用的放線菌菌株AL-04，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)對辣椒早疫病和草莓灰霉病等都具有較好的防治效果。劉琴等[6 ]從健康黃瓜植株的根際分離獲得放線菌菌株SR-1102，研究表明該菌株對黃瓜枯萎病菌菌絲的生長有著較強的抑制作用。涂璇等[7 ]從黃瓜葉片中分離出1株抑菌譜較廣的內(nèi)生放線菌菌株gCLA4，該菌株的發(fā)酵濾液對供試12種靶標真菌的菌絲生長均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。辛春艷等[8 ]從健康番茄植株體內(nèi)分離篩選出1株內(nèi)生放線菌菌株NO.37，該菌株對番茄灰霉病菌和蘋果輪紋病菌的抑菌率達到了近85%～93%。周永強等[9 ]發(fā)現(xiàn)放線菌Act1菌株可作為生物防御屏障，在西瓜根域土壤穩(wěn)定定殖并且產(chǎn)生大量有益拮抗型細菌，以此來防御西瓜枯萎病菌的侵染。這些研究結(jié)果不僅為安全、無毒、高效的微生物農(nóng)藥的開發(fā)與利用提供了良好的試驗基礎(chǔ)，也為不同類型放線菌的研發(fā)拓展視野。

放線菌是一類極具價值的微生物資源，目前已知的眾多源于微生物的活性物質(zhì)中有70%都是由放線菌產(chǎn)生的，其中鏈霉菌屬產(chǎn)生的最多[10 ]。前期研究發(fā)現(xiàn)，放線菌產(chǎn)生的主要活性物質(zhì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不僅結(jié)構(gòu)復雜而且不穩(wěn)定[11 ]。不論是何種放線菌，它產(chǎn)生的活性物質(zhì)在自然環(huán)境中都表現(xiàn)出不穩(wěn)定的特性，因此，農(nóng)用抗生素噴灑到農(nóng)作物表面或滲入到土壤，都要受到光照、溫度、土壤酸堿性、殘留農(nóng)藥等的影響[12 - 13 ]，研究和解決農(nóng)藥與農(nóng)用抗生素的復配問題，已成為當前農(nóng)用抗生素研究的熱點。

由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病害生物防治實驗室分離并保存的拮抗放線菌ZZ-9，前期試驗鑒定為婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei），并發(fā)現(xiàn)該菌株對蘋果樹腐爛病病菌具有良好的抑制作用。但放線菌ZZ-9作為新型生防材料在防治蘋果樹腐爛病時會受到各種因子的影響，從而影響防治效果。新型農(nóng)用抗生素能否發(fā)揮其最大效果的重要指標之一，就是該抗生素在大田環(huán)境下施用的穩(wěn)定性能[14 ]。本研究分別測定放線菌ZZ-9（專利保存號：CGMCC No.15245）對70%甲基硫菌靈、1.9%辛菌胺醋酸鹽、60%戊唑·丙森鋅、10%苯醚甲環(huán)唑在 50、100、200、400、800 μg/mL等不同濃度下的敏感程度，以及在不同溫度下的敏感性，以明確該菌株的抗藥及耐高溫、低溫性能。為放線菌ZZ-9的深層次開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）ZZ-9菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病害生物防治實驗室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 高氏1號培養(yǎng)基，配方為： KNO3 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、可溶性淀粉20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.1.3 供試藥劑 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（山東省鄒平縣德興化工有限公司）、1.9%辛菌胺醋酸鹽水劑（桂林杰靈達生物科技有限公司）、60%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑（山東海訊生物科技有限公司）、10%苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑（山東奧德利化工有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防放線菌ZZ-9對不同化學殺菌劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[15 ]，將70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、1.9%辛菌胺醋酸鹽水劑、60%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑分別用無菌水以推薦使用濃度為基礎(chǔ)，稀釋成一定濃度的母液，用移液槍吸取1 mL已配好的母液加入適當冷卻的49 mL高氏1號培養(yǎng)基中，快速充分搖勻后，倒入培養(yǎng)皿制成一定質(zhì)量濃度的含藥平板。質(zhì)量濃度分別為600，700，800，900，

1 000，1 200 μg/mL。將事先于25 ℃的培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)好的放線菌ZZ-9菌株，用打孔器（d=5 mm）打取菌餅接種至上述平板中，每個平板接2個。將接菌后的平板放入25 ℃ 的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，7 d后觀察菌落生長情況，并確定放線菌ZZ-9對各供試殺菌劑的最低抑制濃度（MIC）[16 ]。

確定各供試殺菌劑的最低抑制濃度后，將70%甲基硫菌靈、1.9%辛菌胺醋酸鹽、60%戊唑·丙森鋅、10%苯醚甲環(huán)唑從800 μg/mL的濃度開始，依次遞減，分別配制質(zhì)量濃度分別為800、400、200、100、50 μg/mL的含藥高氏1號平板，按上述方法接菌并培養(yǎng)，每個濃度做3個重復試驗，以不加藥劑的培養(yǎng)基為對照。7 d后，采用十字交叉法測量每個平板內(nèi)的菌落生長直徑，并計算各化學殺菌劑對放線菌ZZ-9菌絲生長的抑制率，計算公式為：

抑菌率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（處理菌落直徑-0.5 mm）]×100%。

將殺菌劑有效濃度換算成濃度對數(shù)設為自變量（x），抑制率換算成機率值設為因變量（y），按照線性回歸法計算出毒力回歸方程y=ax+b和相關(guān)系數(shù)r，進一步用回歸方程計算各化學藥劑對菌絲生長的有效抑制中濃度EC50（將y=5代入毒力回歸方程解得x后，反常數(shù)即為EC50值）[17 - 18 ]。

1.2.2 生防放線菌ZZ-9菌株對不同溫度的敏感性測定 采用平板劃線法將菌株 ZZ-9 轉(zhuǎn)接于高氏一號平板上，分別置于15、20、25、30、35、40、45 ℃，7個溫度梯度下培養(yǎng)7 d，每組處理3次重復，每隔24 h觀察菌落生長狀況，測量單個菌落的直徑。若單個菌落直徑越小，說明菌株ZZ-9對此溫度的敏感性越高，不利于ZZ-9的存活；若單個菌落直徑越大，則說明菌株ZZ-9對此溫度的敏感性越低，在此溫度下菌株ZZ-9能夠更好的存活。通過測量結(jié)果得出菌株致死最高溫度和不能生長的最低溫度[19 - 20 ]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的整理及圖表的制作采用Excel 2010，數(shù)據(jù)的處理及顯著性分析采用SPSS24.0進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種殺菌劑對生防放線菌ZZ-9的抑制率

測定結(jié)果表明（表1），4種殺菌劑在不同濃度下都對放線菌ZZ-9菌絲的生長有明顯的抑制作用，且其抑制率隨濃度的增加而增大。其中戊唑·丙森鋅對放線菌ZZ-9菌絲生長的抑制作用最大，抑制率均大于其他藥劑處理，抑制效果見圖1；辛菌胺醋酸鹽和苯醚甲環(huán)唑?qū)Ψ啪€菌ZZ-9菌株菌絲的生長抑制作用次之（圖2、圖3）。甲基硫菌靈的抑制作用最?。▓D4），而且在質(zhì)量濃度為100 μg/mL和50 μg/mL時的抑制率差異不顯著（P > 0.05）。

2.2 4種殺菌劑對放線菌ZZ-9的EC50比較

利用線性回歸方程計算毒力回歸方程和各自的EC50值，進而比較放線菌ZZ-9對4種殺菌劑的敏感性。結(jié)果（表2）表明，放線菌ZZ-9對4種藥劑都表現(xiàn)出一定的敏感性，EC50值大小依次是70%甲基硫菌靈（267.55 μg/mL）、1.9%辛菌胺醋酸鹽（139.51 μg/mL）、10%苯醚甲環(huán)唑（108.22 μg/mL）、60%戊唑·丙森鋅（82.99 μg/mL）。由此可見，放線菌ZZ-9對70%甲基硫菌靈的抗藥性最強，對1.9%辛菌胺醋酸鹽和10%苯醚甲環(huán)唑的抗性較弱，對60%戊唑·丙森鋅的抗性最弱。表明放線菌ZZ-9對4種殺菌劑的敏感性由強到弱依次為60%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑、1.9%辛菌胺醋酸鹽水劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑。

2.3 生防放線菌ZZ-9菌株對不同溫度的敏感性

放線菌ZZ-9菌株對不同溫度的敏感性不同。在不同溫度條件下培養(yǎng)7 d后的結(jié)果表明，ZZ-9菌株在35℃下生長最好，菌落平均直徑為6.400 0 mm；15 ℃下生長最弱，菌落平均直徑為1.866 7 mm，幾乎不能生長；45 ℃高溫情況下菌落平均直徑為3.033 3 mm，幾乎不能生長， 6～7 d后幾乎死亡。ZZ-9菌株的最適溫度為35 ℃，平均直徑為6.400 0 mm。

3 小結(jié)與討論

本研究采用菌絲生長速率法測定放線菌ZZ-9對甲基硫菌靈等4種殺菌劑的敏感性，并測定放線菌ZZ-9對不同溫度的敏感性。放線菌ZZ-9對戊唑·丙森鋅最敏感， EC50值為82.99 μg/mL，菌落生長直徑范圍為0.72～1.12 cm；對70%甲基硫菌靈可濕性粉劑最不敏感，EC50值為267.55 μg/ml，菌落生長直徑范圍0.95 ～1.33 cm。質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，60%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑、1.9%辛菌胺醋酸鹽水劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對該菌株的抑制率分別為46.09%、43.48%、39.13%、27.83%。70%甲基硫菌靈可濕性粉劑質(zhì)量濃度為100 μg/mL和50 μg/mL時的抑制率差異不顯著（P > 0.05）。因此，在70%甲基硫菌靈可濕性粉劑的濃度不大于50 μg/mL時可以考慮和放線菌ZZ-9進行最適比例的復配，減少農(nóng)藥的劑量并增加拮抗菌株活性產(chǎn)物的劑量而使防治效果幾乎不下降。因此，對殺菌劑與放線菌的復配來說，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑比較合適。溫度試驗表明：放線菌ZZ-9菌株在35 ℃下生長最好，15 ℃下生長最弱。45 ℃時生長雖有減弱，但仍有相對較好的活性。證明放線菌ZZ-9具有較好的耐高溫性能，耐低溫性能較差。為后續(xù)放線菌ZZ-9菌株誘變及活性物質(zhì)的提取提供了重要的依據(jù)。

放線菌作為一種拮抗菌類，已有多種新型產(chǎn)品成功研制。比如，殺蟲抗生素類型有從油菜根系土壤中發(fā)現(xiàn)的梅嶺霉素、源于多刺糖多孢菌的多殺菌素、具有觸殺和胃毒效應的阿維菌素；殺菌抗生素類型有源于小金色放線菌的春雷霉素，多用于防治枯萎和霉病、環(huán)狀酯肽類物質(zhì)萬隆霉素，可抑制真菌和細菌的生長；除草抗生素類型有適于一年和多年生雜草的三肽物質(zhì)雙丙氨膦等[21 ]。吳慶菊等[22 ]從熱帶林區(qū)土壤中篩選分離出一株放線菌WZ162，以香蕉枯萎病為指示菌，經(jīng)室內(nèi)活性檢測發(fā)現(xiàn)具有較高的抑菌活性，發(fā)酵液在不同溫度下處理時抑菌活性各有差異，4 ℃和37 ℃不變，50 ℃有下降趨勢；在酸性環(huán)境下抑菌率為24.92%～37.73%，堿性環(huán)境下抑菌率為11.21%～ 25.39%；紫外光照射下90 min后的抑菌率有所降低。成丹[23 ]根據(jù)前期試驗發(fā)現(xiàn)，絳紅褐鏈霉菌YSSPG3沒有經(jīng)過藥劑馴化前對核盤菌、暗胞節(jié)菱孢菌和橄欖根腐病的抑制率都比較低，當用百菌清和多菌靈馴化后抑菌活性明顯增大，而且耐藥菌株的抗藥性和穩(wěn)定性也上升了很大空間。張偉衛(wèi)等[24 ]從江蘇和廣西分離出6株放線菌，通過對百菌清等7種化學藥劑的敏感性測定，發(fā)現(xiàn)各菌株對不同藥劑的耐藥性各有差異但不明顯，且部分藥劑對部分菌株有交互抗性特點。這些研究均表明放線菌作為農(nóng)用抗生素在投入使用時會不同程度的受到很多因素的影響。

由于供試的殺菌劑數(shù)量較少，本研究還不能完全確定放線菌ZZ-9對沒有測試的化學藥劑，包括一些生長調(diào)節(jié)劑、除草劑、農(nóng)用抗生素等的耐藥程度。溫度試驗只設計了15 ～45 ℃，范圍較小，沒有涉及到50 ℃以上高溫及10 ℃以下低溫。另外，本研究只針對該菌株在室內(nèi)固定濕度下測定的敏感性，而對于戶外由于光照、空氣相對濕度等因素引起的、不同藥劑及溫度處理對放線菌ZZ-9的敏感性是否存在差異有待進一步研究。

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（本文責編：陳 珩）