尹祥佳　郝楠　南銘　李世風(fēng)　李艷玫　賈國(guó)軍

摘要：從玉米基因組DNA提取、引物的篩選、PCR反應(yīng)體系優(yōu)化、部分推廣玉米品種純度鑒定引物信息等方面綜述了SSR分子標(biāo)記在玉米雜交種純度鑒定方面的研究及應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：SSR；玉米；純度鑒定；研究及應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào)：S513 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2018）11-0097-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.027

Research and Application of SSR Molecular Markers to Identify Purity of Corn Hybrid

YIN Xiangjia1， HAO Nan1， NAN Ming 2， LI Shifeng 3， LI Yanmei 1， JIA Guojun 1

（1. Lanzhou Vocational and Technical College， Lanzhou Gansu 730070， China； 2.Dingxi Academy of Agricultural Sciences， Dingxi Gansu 743000， China； 3.Gansu Dunhuang Seed Co.， Ltd.， Jiuquan Gansu 735000， China）

Abstract：In this paper， the research and application of SSR molecular markers in the purity identification of corn hybrids were reviewed from the aspects of genomic DNA extraction， primer screening， PCR reaction system optimization and primer information for purity identification of some corn cultivars.

Key words：SSR； Corn； Purity identification； Research and application

玉米是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，也是我國(guó)種植面積和產(chǎn)量最大的作物[1 - 4 ]。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局2017年糧食產(chǎn)量公告[5 ]，在2017年國(guó)家繼續(xù)采取調(diào)整農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)，加快優(yōu)化區(qū)域布局，特別是大幅度調(diào)減“鐮刀彎”地區(qū)玉米播種面積的大背景下，全國(guó)糧食播種面積為1.122億hm2，谷物播種面積0.929億hm2，玉米播種面積為0.355億hm2，占谷物播種面積的38.21%，占糧食播種面積的31.64%。2017年全國(guó)糧食總產(chǎn)量 6 179億kg，玉米總產(chǎn)量2159億kg，占糧食總產(chǎn)量的34.94%。作為我國(guó)第一大作物的玉米在保障國(guó)家糧食生產(chǎn)和安全中具有舉足輕重的地位[6 ]。2016年新實(shí)施的《種子法》在原有國(guó)審和?。▍^(qū)）玉米品種審定制度的基礎(chǔ)上增加了綠色通道、聯(lián)合試驗(yàn)體以及引種備案制等，簡(jiǎn)化了玉米品種審定程序，縮短了審定時(shí)間。玉米品種是決定玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的決定因素。根據(jù)農(nóng)業(yè)部種子管理局中國(guó)種業(yè)大數(shù)據(jù)平臺(tái)顯示，截至2017年，我國(guó)已有審定玉米品種8 972個(gè)，其中國(guó)審品種588個(gè)，主要集中在科研院所和種業(yè)公司[7 ]。目前我國(guó)種子企業(yè)為4 660家，注冊(cè)資本在1億元以上的種業(yè)企業(yè)有200多家，前50強(qiáng)種子企業(yè)的銷(xiāo)售額達(dá)到219億元，集中度為35.54%[8 ]，由此可見(jiàn)，玉米是我國(guó)種業(yè)市場(chǎng)份額占比較大的作物。

隨著我國(guó)玉米種業(yè)市場(chǎng)化程度日益提高，純度鑒定成為種子質(zhì)量檢測(cè)的核心指標(biāo)。種子純度是衡量種子質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，對(duì)玉米產(chǎn)量及品質(zhì)具有直接的影響。玉米種子純度受制種基地隔離標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施的差異性，制種過(guò)程中的去雜、去雄的及時(shí)性與徹底性，制種農(nóng)戶(hù)對(duì)技術(shù)規(guī)程的執(zhí)行程度等綜合因素的共同影響[9 ]。甘肅省已形成以河西走廊為主、以沿黃灌區(qū)和隴南為補(bǔ)充的全國(guó)規(guī)模最大、最具有競(jìng)爭(zhēng)力的玉米制種基地，雜交玉米制種產(chǎn)量占到全國(guó)玉米制種量的60%以 上[10 ]。因此，如何快速、有效地鑒別雙親、混雜品種和真實(shí)雜交種成為品種純度鑒定的關(guān)鍵[11 ]。分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的一類(lèi)遺傳標(biāo)記，較形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記具有遺傳穩(wěn)定好、多態(tài)性高、標(biāo)記遍布整個(gè)基因組、無(wú)組織特異性而且不受外界自然環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，在玉米基因精細(xì)定位、遺傳多樣性分析、劃分雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群、分子標(biāo)記輔助育種、指紋圖譜構(gòu)建、玉米種子純度鑒定等方面都有研究和應(yīng)用[12 ]。分子標(biāo)記主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、以及基于特定引物PCR的簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）、序列特異擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）、靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（TRAP）等方法[13 - 14 ]。

隨著SSR分子標(biāo)記技術(shù)的深入研究和發(fā)展，其在玉米育種及品種純度鑒定方面發(fā)揮著重要的作用。SSR分子標(biāo)記一般由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，具有遺傳多態(tài)性高、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，在玉米品種純度鑒定方面有著廣泛的應(yīng)用[15 ]。農(nóng)業(yè)部公布的玉米品種鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY/T1432 — 2014）使SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米品種純度鑒定的方法更加完善和準(zhǔn)確[16 - 17 ]。我們從玉米基因組DNA提取、引物的篩選、PCR反應(yīng)體系優(yōu)化、部分推廣玉米品種純度鑒定引物信息等方面綜述了SSR分子標(biāo)記在玉米雜交種純度鑒定方面的研究及應(yīng)用。

1 DNA提取方法

DNA提取是SSR分子標(biāo)記最基本的步驟，提取DNA的質(zhì)量要滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增反應(yīng)要求， DNA的提取方法主要有SDS法、CTAB法、堿裂解法和磁珠法。

1.1 SDS法

SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種已知的能使蛋白質(zhì)變性的去污劑，在核酸抽提中可破壞細(xì)胞壁及裂解核酸，在較高溫度下破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來(lái)。SDS法提取DNA選用的玉米材料有單粒干種子胚、葉片。高文偉等[18 ]用SDS法優(yōu)化建立了玉米單粒種子胚和葉片DNA快速提取方法。李蔥蔥等[19 ]用SDS法借助高通量組織研磨儀建立了用于玉米葉片基因組DNA的微量快速提取方法，用高通量組織研磨儀快速研磨液氮處理過(guò)的葉片，實(shí)現(xiàn)了高通量提取基因組DNA的目的，提高了DNA提取的效率。

1.2 CTAB法

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中，CTAB提取液與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入冰乙醇沉淀即可使DNA分離出來(lái)。CTAB法選用的提取玉米材料有干種子、單粒干種子胚、發(fā)芽的種子幼苗、葉片。董永軍等[20 ]采用改良CTAB法，直接用全自動(dòng)樣品快速研磨儀研磨玉米干種子來(lái)提取DNA。李藝等[21 ]將干種子水浴后取出胚研磨后加入CTAB提取液提取DNA。李汝玉等[22 ]用改良的CTAB提取法分別從粉碎的干種子和發(fā)芽4 d的種子幼苗中提取DNA。戴軍等[23 ]研究了兩步CTAB法提取玉米基因組DNA作為PCR反應(yīng)模版。王芳等[24 - 25 ]采用改良的CTAB法，以發(fā)芽的種子幼苗為材料提取玉米基因組DNA。由此可見(jiàn)，CTAB法是目前提取玉米基因組DNA比較常用和成熟的方法，再借助高通量組織研磨儀可以實(shí)現(xiàn)高通量的DNA提取，為玉米分子檢測(cè)提供了有效的基礎(chǔ)。

1.3 堿裂解法

堿裂解法主要用于單粒種子胚和幼芽的DNA提取，具有提取速度快，高通量的優(yōu)點(diǎn)[26 ]。郭景倫等[27 - 28 ]分別從干種子的胚和玉米幼芽中用堿裂解法提取DNA，直接用沸水加熱后加入TE緩沖液用于PCR擴(kuò)增。吳向遠(yuǎn)等[29 ] 采用堿裂解法從玉米單子粒胚中快速提取了基因組DNA。閆米格 等[30 ]將干種子胚放入96 孔深孔板中，用0.1 MNaOH來(lái)提取DNA。但堿裂解法在試驗(yàn)過(guò)程中存在重復(fù)性和與引物的匹配性不高的情況，在引物篩選和建立PCR反應(yīng)體系方面還存在一定的局限性，影響一些玉米品種純度鑒定結(jié)果。

1.4 磁珠法

磁珠法是利用超順磁微球顆粒表面修飾一些活性官能團(tuán)，使其與核酸分子結(jié)合，在磁場(chǎng)作用下，可以將帶有DNA分子的磁珠與溶液分離，之后通過(guò)漂洗過(guò)程除去雜質(zhì)，再用TE緩沖液或者雙蒸水洗脫吸附在磁珠顆粒表面的DNA。磁珠法提取玉米基因組DNA 時(shí)需要注意要提前30 min將試劑盒中保存于2～8 ℃的磁珠和洗滌液平衡至室溫，將裂解液置于50 ℃水浴中溶解并搖勻。徐 潮[31 ]研究建立了磁珠法快速提取玉米基因組DNA的方法，用3種便攜式提取裝置替代了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室儀器。陳麗麗等[32 ]的研究結(jié)果表明，磁珠法提取玉米基因組DNA的得率最高，時(shí)間最短。此外，磁珠法提取DNA的量多，操作簡(jiǎn)便，整個(gè)提取過(guò)程可以在96孔深孔板中進(jìn)行，常選用志昂生物科技有限公司普通植物DNA磁珠法提取試劑盒，借助自動(dòng)提取儀器，編輯程序，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取，但磁珠法存在DNA提取成本較高的問(wèn)題。

綜上所述，在玉米基因組DNA提取過(guò)程中以上4種常用方法都在使用，但是為了滿(mǎn)足高通量的鑒定要求，大部分實(shí)驗(yàn)室使用高通量的組織研磨儀來(lái)代替手工研磨，以降低工作量，提高效率。采用改良的SDS法和CTAB法，選用干種子或者干種子的胚，減少提取試劑的使用量和提取步驟，也取得了良好的效果。采用堿裂解法提取玉米干種子胚DNA，既節(jié)省了發(fā)芽時(shí)間和繁瑣的DNA提取時(shí)間，具有簡(jiǎn)單、快速、易操作等優(yōu)點(diǎn)，提取的DNA質(zhì)量可以滿(mǎn)足PCR 擴(kuò)增的需要。但是為了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，同時(shí)考慮試驗(yàn)成本的因素，建議選用CTAB法來(lái)提取玉米基因組DNA。

2 引物的篩選

近些年玉米基因組學(xué)和生物信息學(xué)的研究與發(fā)展，為玉米SSR標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。Maize GDB（https：//www.maizegdb.org）中含有大量的SSR標(biāo)記引物信息數(shù)據(jù)，可以直接查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)或者參考相關(guān)研究文獻(xiàn)，將現(xiàn)有的SSR標(biāo)記引物用于玉米品種純度鑒定試驗(yàn)。品種純度鑒定之前要根據(jù)具體的試驗(yàn)玉米品種對(duì)引物進(jìn)行篩選來(lái)確定最優(yōu)的SSR標(biāo)記鑒定引物。王陸軍等[33 ]根據(jù)前期研究的成果確定了10對(duì)核心引物，并用核心引物對(duì)18份山西省主推玉米雜交種及其自交系進(jìn)行了引物篩選，得出了多態(tài)性綜合表現(xiàn)最好的umc1590和umcl196等2對(duì)引物，可用于鑒定大部分品種的純度。王風(fēng)格等[34 ]用10對(duì)SSR引物將420份已知玉米雜交種進(jìn)行DNA指紋分析，確定了bnlg161和bnlg1450等2對(duì)作為玉米雜交種純度鑒定的首選核心引物，bnlg439、bnlg125、umc2105、umcl705和bnlg1792等5對(duì)引物作為備選核心引物，可以鑒定出412個(gè)玉米品種的純度。由此可見(jiàn)，引物的篩選對(duì)檢測(cè)的結(jié)果有著決定性的影響，1對(duì)引物可以檢測(cè)多個(gè)品種，有時(shí)候也需要2對(duì)以上的引物來(lái)鑒定1個(gè)品種的純度，因此，建立玉米品種的引物信息共享數(shù)據(jù)庫(kù)具有重要意義。

3 PCR反應(yīng)優(yōu)化

在SSR分子標(biāo)記鑒定玉米雜交種純度的試驗(yàn)中，做好PCR反應(yīng)的優(yōu)化對(duì)檢測(cè)結(jié)果起著重要的作用。PCR反應(yīng)優(yōu)化有PCR反應(yīng)體系和PCR儀反應(yīng)條件的優(yōu)化兩個(gè)方面。PCR反應(yīng)體系針對(duì)玉米基因組DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP等反應(yīng)物質(zhì)混合體積的組合。目前所需要的反應(yīng)試劑都可以向?qū)ｉT(mén)的生物技術(shù)公司購(gòu)買(mǎi)直接使用，有些公司還提供DNA聚合酶、dNTP和buffer的混合PCR反應(yīng)試劑，使用的時(shí)候直接加入引物和雙蒸水，可以有效縮短樣品純度檢測(cè)時(shí)間。除此之外還要考慮在保證檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的基礎(chǔ)上適當(dāng)?shù)臏p少反應(yīng)體系的總體積，這樣可以在一定程度上節(jié)約試驗(yàn)成本。王士磊等[35 ]對(duì)玉米SSR-PCR體系從模板DNA、dNTP、引物、DNA聚合酶濃度4種因素4個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化分析，并對(duì)退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，建立了10 μL的高效、實(shí)用、穩(wěn)定的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)優(yōu)化要建立在高度的可重性的基礎(chǔ)上，減少檢測(cè)試驗(yàn)的成本，以最少的體系量和最佳的PCR反應(yīng)程序來(lái)得出準(zhǔn)確的結(jié)果。

4 部分推廣玉米品種純度鑒定引物信息

現(xiàn)將文獻(xiàn)報(bào)道和在MaizeGDB中補(bǔ)充查詢(xún)到的部分推廣玉米品種的純度鑒定所需要SSR標(biāo)記引物信息進(jìn)行了匯總（表1）[36 - 51 ]，供相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供參考。

5 結(jié)束語(yǔ)

SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于鑒定玉米品種純度，大大縮短了種子純度的檢測(cè)時(shí)間，及時(shí)確定不同玉米品種種子質(zhì)量，防止不合格種子播種，對(duì)保護(hù)農(nóng)戶(hù)種植利益、玉米生產(chǎn)安全，促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)村社會(huì)穩(wěn)定起到了積極的促進(jìn)作用。主要表現(xiàn)在以下三個(gè)層面。第一個(gè)層面是玉米種業(yè)企業(yè)可以利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確快速檢測(cè)玉米種子的純度，保證種子的真實(shí)性，這樣可以建立起玉米種業(yè)企業(yè)的制種質(zhì)量監(jiān)控體系，有效促進(jìn)玉米田間制種技術(shù)規(guī)程的使用效果，嚴(yán)格做好去雜和去雄的工作。SSR標(biāo)記可以非常有效地將品種親本自交系進(jìn)行區(qū)別，為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可以通過(guò)多對(duì)標(biāo)記引物逐一對(duì)同一樣品進(jìn)行鑒定，或者利用多重PCR將多對(duì)引物混合起來(lái)進(jìn)行純度鑒定。第二個(gè)層面主要是國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種保護(hù)辦公室在受理玉米新品種保護(hù)時(shí)，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)做好DUS測(cè)試的部分內(nèi)容，給申請(qǐng)品種一個(gè)身份權(quán)利保護(hù)標(biāo)識(shí)，防止該玉米品種被其他品種冒充，對(duì)玉米新品種加強(qiáng)保護(hù)的效力。第三個(gè)層面是每年各級(jí)種子管理部門(mén)的春季種子市場(chǎng)執(zhí)法檢查，其中主要是對(duì)品種的真實(shí)性和種子純度進(jìn)行檢查和檢測(cè)，以此來(lái)保護(hù)農(nóng)戶(hù)的合法權(quán)益，維護(hù)玉米生產(chǎn)安全。

隨著SSR分子標(biāo)記技術(shù)與信息技術(shù)的結(jié)合，如何有效建立快速鑒定農(nóng)作物品種純度和真實(shí)性的方法，使得玉米品種純度的鑒定可以在植株任何生長(zhǎng)階段都能快速進(jìn)行成為了新的研究課題。同時(shí)還要利用互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)，在國(guó)家主管部門(mén)的指導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)在不同實(shí)驗(yàn)室和不同企事業(yè)單位之間的共享，有效的打擊玉米假冒偽劣品種，提高玉米種子的供應(yīng)質(zhì)量，促進(jìn)我國(guó)農(nóng)作物品種產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，今后將涌現(xiàn)許多更有效的新型分子標(biāo)記，還要將SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步改良與完善，開(kāi)發(fā)新型SSR-PCR結(jié)果讀取儀器，做到智能化和高通量，提高玉米種子純度的檢測(cè)質(zhì)量和效率。只有這樣，SSR分子標(biāo)記技術(shù)才能為玉米種子純度的高效檢測(cè)和建立玉米種業(yè)產(chǎn)業(yè)的信息化質(zhì)量監(jiān)控體系提供技術(shù)支撐。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）