徐秋穎,劉偉偉,王寶家,馬秀英,高永翔*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610075;2.藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610000)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)發(fā)生于許多不同病因引發(fā)的肺間質(zhì)疾病,生理特點(diǎn)表現(xiàn)為肺泡持續(xù)性損傷、成纖維細(xì)胞(fibroblast)增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積,從而導(dǎo)致肺組織反復(fù)破壞、修復(fù),最終造成肺組織中的大量膠原沉積[1].康復(fù)新液是由美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)干燥蟲體的乙醇提取物制成的溶液,其主要成分包括氨基酸(17種以上,包含人體必需氨基酸)、多肽(抗菌肽、咽側(cè)體抑制神經(jīng)肽、焦激肽等)、多糖(硫酸黏多糖等)、核苷(次黃嘌呤、尿嘧啶等)及油脂等[2].《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“味咸、寒,生川澤,治血癖癥堅(jiān)、寒熱,破積聚,喉咽痹,內(nèi)寒無子”.康復(fù)新液可“通利血脈,養(yǎng)陰生肌”,內(nèi)服可治消化道出血與潰瘍等,外用可療金瘡、外傷等,具有改善黏膜創(chuàng)面微循環(huán)、加速機(jī)體病損組織修復(fù)再生、增強(qiáng)免疫力等功能.已有研究顯示康復(fù)新液可以改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎,治療小兒手足口病、帶狀皰疹、干癥、頭頸部惡性腫瘤等[3].隨著臨床使用康復(fù)新液的范圍不斷擴(kuò)大,其更多藥效有待挖掘,而目前尚無關(guān)于其應(yīng)用于肺纖維化治療的報(bào)道.

在肺纖維化的進(jìn)程中,許多因子參與調(diào)控,其中最重要的是轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1[4-5],它可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移、增殖及其向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,加速ECM的過度分泌,逐漸以纖維組織取代正常的肺組織,對肺功能造成不可逆的破壞.結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是TGF-β1誘導(dǎo)的早期基因表達(dá)產(chǎn)物,在病理狀態(tài)下,纖維化組織中CTGF的表達(dá)量會明顯增加[6].這個(gè)過程中肌成纖維細(xì)胞會表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)這種獨(dú)特的分子[7],而α-SMA增多可明顯增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞的遷移及收縮能力,進(jìn)而增強(qiáng)ECM的合成和分泌.ECM的主要成分是纖維連接蛋白(fibronectin,FN)和層黏連蛋白(laminin,LN),其中FN可以誘導(dǎo)膠原的形成,從而導(dǎo)致臟器的纖維化[8].FN、LN及膠原的合成增多、降解減少會導(dǎo)致ECM的過度積聚,進(jìn)而導(dǎo)致纖維化.肺纖維化時(shí)還會出現(xiàn)基底膜增厚，這主要與FN和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)表達(dá)明顯增加有關(guān)[9].本研究選取α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、Ⅲ型膠原蛋白(CollagenⅢ)這6種反映肺纖維化程度的因子,作為檢測康復(fù)新液對肺纖維化是否有效的客觀指標(biāo).通過肺纖維化中的關(guān)鍵因子TGF-β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞(human fetal lung fibroblast)MRC-5細(xì)胞系,構(gòu)建細(xì)胞纖維化模型.驗(yàn)證此模型成功后,運(yùn)用CCK-8(cell counting kit-8)法檢測康復(fù)新液對MRC-5細(xì)胞的毒性,得出康復(fù)新液對MRC-5細(xì)胞的最高不致死給藥濃度.進(jìn)而使用此安全濃度干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化,從而在細(xì)胞層面實(shí)現(xiàn)康復(fù)新液治療肺纖維化的有效性驗(yàn)證,旨在擴(kuò)大中成藥康復(fù)新液的適應(yīng)范圍,從干預(yù)肺纖維化的角度對其進(jìn)行二次開發(fā).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

MRC-5細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,使用MEM(minimum essential medium)培養(yǎng)基(Gibco,41500034),添加10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(Gibco,10099-141),于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),5～7 d傳代,按1瓶細(xì)胞傳2～3瓶的比例進(jìn)行.

1.2 試劑及耗材

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測試劑Realtime PCR Master Mix(QPK-201)、反轉(zhuǎn)錄試劑ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix(FSQ-201)購自ToYoBo公司,RNA抽提試劑TRIzolTMPlus RNA Purification Kit(12183555)購自Invitrogen公司.地塞米松(Dexamethasone,DXM;5 mg/mL,02138)購自西南藥業(yè)股份有限公司.LN抗體(ab11575)、FN抗體(ab2413)、α-SMA抗體(ab124964)購自Abcam公司,CTGF抗體(86641)購自CST公司,CollagenⅠ抗體(14695-1-AP)購自Proteintech公司,CollagenⅢ抗體(OM275892)購自O(shè)mnimabs公司,內(nèi)標(biāo)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(200306-7E4)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠(511103)與羊抗兔(511203)二抗購自Zen-bioscience公司.無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑.所用耗材均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，為一次性無RNA酶耗材.

1.3 主要設(shè)備和儀器

qRT-PCR儀(CFX96,Bio-Rad公司)、離心機(jī)(5415D,Eppendorf公司)、微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000,Thermo Fisher公司)、全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum,Thermo Fisher公司),高速冷凍離心機(jī)(Legend Microfuge 22R Centrifuge,Thermo Fisher公司).

1.4 引 物

本研究中所使用的引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成,序列見表1.

表1 引物及其序列

1.5 MRC-5細(xì)胞纖維化模型的建立與檢測

MRC-5細(xì)胞接種24 h后加入TGF-β1(10 ng/mL)進(jìn)行誘導(dǎo)[10],分別在0,48與72 h取樣;使用TRIzolTMPlus RNA Purification Kit進(jìn)行RNA抽提,測定RNA濃度及純度,并用反轉(zhuǎn)錄試劑ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix按照1 μg/10 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;之后以GAPDH為內(nèi)參,于qRT-PCR儀檢測α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ的mRNA表達(dá)水平.20 μL反應(yīng)體系:SYBR(2×)10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,無核酸酶水6.4 μL.反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性 5 s,60 ℃退火延伸30 s,40個(gè)循環(huán).以2-ΔΔCt法進(jìn)行mRNA相對表達(dá)水平的分析.

1.6 CCK-8法檢測

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按照每孔細(xì)胞數(shù)104接種,24 h后分別加入10倍、20倍、40倍、80倍、160倍及320倍稀釋的康復(fù)新液(使用完全培養(yǎng)基稀釋),同時(shí)設(shè)置不加藥對照;培養(yǎng)72 h后加入1/10培養(yǎng)基體積的CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)1 h,采用酶標(biāo)儀記錄450 nm的吸光度,繪制生長曲線.

1.7 康復(fù)新液干預(yù)

*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,下同.圖1 TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型中纖維化指標(biāo)的mRNA相對表達(dá)水平Fig.1 Relative mRNA expression levels of fibrosis indexes in the MRC-5 cell fibrosis model induced by TGF-β1

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按照每孔細(xì)胞數(shù)105接種,細(xì)胞貼壁后加入10 ng/mL的TGF-β1進(jìn)行纖維化誘導(dǎo),24 h后加入最高不致死給藥濃度的康復(fù)新液進(jìn)行干預(yù);在干預(yù)24,48與72 h時(shí)取樣,用于qRT-PCR與蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)檢測,同時(shí)設(shè)置DXM(50 μg/mL)陽性對照組,處理72 h后取樣.分別檢測α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ及GAPDH(內(nèi)參)的表達(dá)量.qRT-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照1.5小節(jié)步驟.WB操作如下:使用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕洗滌細(xì)胞樣品3次,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液,4 ℃裂解20 min,12 000 r/min離心5 min后收取上清;BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶,濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜,5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白封閉1 h后加入一抗，4 ℃孵育過夜；含0.5%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20的Tris-鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次后加入HRP標(biāo)記二抗,37 ℃孵育1 h后用TBST洗滌3次；加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光液,于化學(xué)發(fā)光成像儀下拍照.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型檢測

以10 ng/mL TGF-β1處理MRC-5細(xì)胞,通過qRT-PCR分別檢測0,48,72 h后α-SMA、LN、FN、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ這6個(gè)特異性纖維化指標(biāo)的mRNA相對表達(dá)水平,結(jié)果如圖1所示:FN、CTGF、CollagenⅢ的mRNA相對表達(dá)水平在48 h出現(xiàn)顯著升高,α-SMA、LN、CollagenⅠ的mRNA相對表達(dá)水平則在72 h出現(xiàn)顯著升高,可見MRC-5細(xì)胞在TGF-β1誘導(dǎo)下48 h時(shí)出現(xiàn)纖維化,72 h時(shí)纖維化充分,呈現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性,說明72 h時(shí)此模型誘導(dǎo)成功.

2.2 康復(fù)新液對MRC-5細(xì)胞的毒性檢測

1.空白對照;2.TGF-β1誘導(dǎo)模型;3～5.康復(fù)新液干預(yù)24，48，72 h;6.DXM陽性對照(下同).圖3 康復(fù)新液干預(yù)不同時(shí)間后TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5纖維化細(xì)胞模型中纖維化指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of fibrosis indexes after Kangfuxin liquid treatment on the MRC-5 cell fibrosis model for different time

通過CCK-8法檢測不同稀釋倍數(shù)的康復(fù)新液對MRC-5細(xì)胞的毒性,結(jié)果見圖2:MRC-5細(xì)胞在10～40倍稀釋的康復(fù)新液作用下增殖受強(qiáng)烈抑制,在80倍稀釋的康復(fù)新液作用下有明顯增殖,160倍及以上稀釋的康復(fù)新液作用下與空白對照基本一致.由此可見最高不致死給藥濃度為80倍稀釋,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用80倍稀釋作為康復(fù)新液的處理濃度.

圖2 CCK-8法檢測康復(fù)新液對MRC-5細(xì)胞的毒性Fig.2 Toxic effects of Kangfuxin liquid on MRC-5 cells by CCK-8 assay

2.3 康復(fù)新液對TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型的干預(yù)

以80倍稀釋的康復(fù)新液干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型,干預(yù)時(shí)間分別為24,48和72 h,通過qRT-PCR儀檢測6個(gè)特異性纖維化指標(biāo)的mRNA相對表達(dá)水平,比較干預(yù)不同時(shí)間的效果差別,結(jié)果如圖3所示:空白對照組和TGF-β1誘導(dǎo)模型組比較有顯著差異；康復(fù)新液干預(yù)組與TGF-β1誘導(dǎo)模型組比較，干預(yù)24 h時(shí)mRNA相對表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下調(diào);康復(fù)新液干預(yù)組72 h時(shí)與DXM陽性對照組相比,α-SMA和FN的mRNA相對表達(dá)無顯著差異,其他纖維化指標(biāo)的mRNA相對表達(dá)水平顯著高于DXM陽性對照組,但也顯著低于TGF-β1誘導(dǎo)模型組.上述結(jié)果表明80倍稀釋的康復(fù)新液可以有效降低TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型中纖維化指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平.

進(jìn)而通過WB方法檢測康復(fù)新液干預(yù)不同時(shí)間后TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型中上述6個(gè)特異性纖維化指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果如圖4所示:TGF-β1誘導(dǎo)模型組和空白對照組相比,各蛋白表達(dá)水平均上調(diào),說明造模成功;康復(fù)新液干預(yù)組與TGF-β1誘導(dǎo)模型組相比,α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表達(dá)水平在24～72 h持續(xù)降低,LN、FN和CTGF蛋白表達(dá)水平在48 h出現(xiàn)明顯降低;康復(fù)新液干預(yù)組與DXM陽性對照組相比,72 h時(shí)康復(fù)新液干預(yù)組中α-SMA、LN、FN和CollagenⅢ蛋白表達(dá)水平略高,CTGF和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平相當(dāng).所得結(jié)果與qRT-PCR儀檢測的趨勢基本一致,表明康復(fù)新液干預(yù)可以有效降低這些纖維化指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平.

圖4 康復(fù)新液干預(yù)不同時(shí)間后TGF-β1誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞纖維化模型中纖維化指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平Fig.4 Relative protein expression levels of fibrosis indexes after Kangfuxin liquid treatment on the MRC-5 cell fibrosis model for different time

3 討 論

在世界范圍內(nèi),組織器官纖維化是許多疾病致殘、致死的主要原因.有關(guān)統(tǒng)計(jì)表明,特發(fā)性肺纖維化的患者從疾病診斷到死亡的時(shí)間僅2～5年,5年生存率僅20%[11].臨床上這類患者大都會使用糖皮質(zhì)激素治療,但是糖皮質(zhì)激素只對1/3的患者有一定的療效,并且長期使用糖皮質(zhì)激素會出現(xiàn)很多不良反應(yīng),如庫欣綜合征、機(jī)體免疫力下降、傷口難愈合等[12].雖然2014年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已批準(zhǔn)肺纖維化的藥物吡非尼酮(pirfenidone)和尼達(dá)尼布(nintedanib)用于臨床,但這兩種藥物只能延緩疾病進(jìn)程,對肺纖維化并沒有實(shí)質(zhì)的治療作用,加之進(jìn)口藥品價(jià)格不菲,難以被患者接受,臨床上使用的安全及有效性仍需要更多的數(shù)據(jù)支持[13].目前國際公認(rèn)的最有效治療方式是肺移植,但是肺移植存在肺供體少、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大、技術(shù)要求高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn),很難在肺纖維化的治療中廣泛選用.因此,拓展新的治療措施并在臨床上推廣有重要的意義.

肺纖維化的形成過程中,成纖維細(xì)胞在TGF-β1的刺激作用下被激活并轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞.而肌成纖維細(xì)胞的胞漿豐富,能夠分泌膠原的同時(shí)還具有收縮功能,具備成纖維細(xì)胞和平滑肌的雙重特性,是造成ECM異常沉積的主要細(xì)胞[14].因此肺成纖維細(xì)胞不斷增殖并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵所在.

本研究成功構(gòu)建了TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞纖維化模型,經(jīng)檢測纖維化特征性因子α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ在建模中的mRNA表達(dá)水平均有所上調(diào).以80倍稀釋的康復(fù)新液干預(yù)此模型后,上述指標(biāo)因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平均有所下調(diào),表明康復(fù)新液對MRC-5細(xì)胞纖維化模型可起到有效的干預(yù)作用,效果與DXM相當(dāng),為抗纖維化的藥物開發(fā)提供了新的思路和方向.但本研究也存在一定的局限性,即本研究中MRC-5細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,經(jīng)過多次培養(yǎng)后細(xì)胞的增殖及可誘導(dǎo)性都有所下降,因此臨床上康復(fù)新液用于肺纖維化患者的效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證.

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