任世英，丁沈利，王 玲，劉 飛

(1.淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，淮安 223003； 2.淮陰工學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，淮安 223003；3.江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實(shí)驗(yàn)室，淮安 223003)

食品安全及食品中防腐劑的安全性等問題引起了人們的高度關(guān)注，使用化學(xué)防腐劑有許多副作用，因此，從天然食品中獲取抑菌劑來抑制食品中腐敗菌和病原菌，從而延長食品保質(zhì)期和加強(qiáng)食品安全性，已經(jīng)成為食品加工領(lǐng)域迫切需要解決的問題[1]。

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。除極少數(shù)外，其中絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中，腸內(nèi)乳酸菌與健康長壽有著非常密切的關(guān)系。乳酸菌可以從傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品中分離獲得，其在生長過程中會產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酞、細(xì)菌素等，這些代謝產(chǎn)物有重要的功能，對常見的腐敗菌和病原菌有明顯的抑制作用，其中細(xì)菌素的研究引起人們重視，因其具備無毒性、高活性、對熱穩(wěn)定、易被人體消化道中的蛋白酶降解、在人體中無殘留等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛用作食品的天然防腐劑和飼料添加劑，有良好的應(yīng)用前景[2]。

20世紀(jì)中期人們研究大腸桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)V菌株對φ菌株有明顯的抑制作用，將該類物質(zhì)分離純化后稱為大腸桿菌素，后來又將這類物質(zhì)稱為細(xì)菌素。隨著對細(xì)菌素的深入研究，人們提出，細(xì)菌素是某些種類的細(xì)菌通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生、能釋放到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的蛋白或多肽類物質(zhì)，其抑菌范圍不僅僅局限于親緣關(guān)系較近的種，對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的某些菌類也有抑制作用[3]，此外，細(xì)菌素對產(chǎn)生菌沒有抑制作用[4]。

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中通過透明圈法分離乳酸菌，篩選出具有較高抑菌活性的菌株，對其菌體形態(tài)、部分生理生化特性、抑菌特性進(jìn)行研究，通過16S rDNA對其進(jìn)行鑒定。以期開發(fā)具有新型生物防腐劑功能的乳酸菌，并為乳酸菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的商業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源：市售泡菜。

所用EscherichiacoliTOP10為實(shí)驗(yàn)室保存，用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

指示菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

PCR用試劑、TaqDNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、MspI酶切試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，合成引物、序列測定由上海生工生物工程有限公司完成，其他藥品和試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基[3]

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O為0.58 g，碳酸鈣30 g，蒸餾水至1 L，pH 6.2～6.4，瓊脂粉15 g，115℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 為3 g，蒸餾水至1 L，pH 7～7.2，115℃滅菌20 min。

石蕊牛奶培養(yǎng)基：牛奶培養(yǎng)基(脫脂奶粉10 g，加水至100 mL)，每100 mL中加入2.5 mL石蕊乙醇溶液(石蕊20 g，研磨后置錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為40%乙醇150 mL，煮沸1 min，倒出上層液，再加入40%乙醇150 mL，煮沸1 min，倒出上層液，與第1次倒出液合并，再以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇加至300 mL，滴加濃度為1 mol/L鹽酸，邊加邊振蕩，至溶液變紫色為止，pH 6～8)，混勻，取5～10 mL分裝于試管中，115°C滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水至1 L，pH 7～7.2，121°C滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的初篩

吸取1 mL泡菜湯，加入裝有9 mL無菌水的試管中，混勻，制成10-1稀釋菌懸液，依照上述操作制備10-2、10-3、10-4和10-5的稀釋液[5]。吸取10-4和10-5的菌懸液各100 μL涂布含有碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h。挑取有碳酸鈣溶解圈的菌落進(jìn)行過氧化氫實(shí)驗(yàn)測試，將過氧化氫實(shí)驗(yàn)呈陰性的菌落，經(jīng)過3次劃線分離純化，然后點(diǎn)種固體MRS平板，每皿點(diǎn)種6個(gè)，培養(yǎng)24 h后，待長出菌落，取出備用[6]。

1.2.2 乳酸菌的復(fù)篩

用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基將指示菌進(jìn)行培養(yǎng)，適溫培養(yǎng)20 h，吸取100 μL菌懸液，與溫度大約45℃左右的5 mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基混合均勻，馬上倒入上述點(diǎn)種有初篩乳酸菌的平板上，37℃培養(yǎng)12 h，根據(jù)點(diǎn)種乳酸菌菌落周圍能否形成抑菌圈來判斷初篩乳酸菌能否產(chǎn)生抑菌性物質(zhì)[7]。將抑菌圈形成明顯的初篩乳酸菌菌株接種于5 mL的MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，分離3次以上獲得純化的菌株，挑取單菌落鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 乳酸菌的形態(tài)特征及鑒定

1)乳酸菌的形態(tài)觀察。將分離到的乳酸菌接種于固體培養(yǎng)基平板，觀察菌落的形態(tài)和顏色變化。挑取菌落細(xì)胞均勻涂布于載玻片，染色后用10×100倍油鏡觀察菌體。

2)乳酸菌的16S rDNA鑒定[7]。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[8]對菌株進(jìn)行初步鑒定。

采用反復(fù)凍融法提取細(xì)菌的總DNA。16S rDNA的通用引物：1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′)和27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3′)。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板2 μL，引物1492R 1 μL，引物27F 1 μL，10×擴(kuò)增緩沖液2.5 μL，dNTP混合液1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，MgCl21.5 μL，補(bǔ)無菌水到25 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后于72℃再延伸10 min。

取2 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后將PCR產(chǎn)物采用純化試劑盒進(jìn)行純化，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。將所得序列與GenBank中核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，找出相似度高的16S rDNA序列，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4 乳酸菌生長曲線繪制

將乳酸菌接種于液體培養(yǎng)基，37℃搖床200 r/min培養(yǎng)，每隔2 h測其OD570值，然后根據(jù)所得OD570值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.5 發(fā)酵上清液的制備

將菌株進(jìn)行活化，按1%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，6000 r/min離心5 min，取出上清液用一次性無菌濾菌器過濾，收集到的液體即為發(fā)酵上清液。以下實(shí)驗(yàn)所用發(fā)酵上清液均采用此方法制備。

1.2.6 指示菌平板的制備

將指示菌斜面菌株，于LB固體平板劃線得到單菌落，挑取單菌落接種于裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)12 h，然后以無菌生理鹽水將3種指示菌分別進(jìn)行稀釋，使菌懸液細(xì)胞濃度為105CFU/mL，各取100 μL涂布LB平板，待表面干燥后放置牛津杯，每板放4個(gè)，即為指示菌平板。

1.2.7 發(fā)酵上清液的pH敏感性

用濃度為1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)整上清液的pH 2、3、4、5、6、7和8，以未處理的發(fā)酵上清液作對照，各取200 μL分別加入到指示菌平板上的牛津杯中，蓋上陶瓦蓋，4℃條件下擴(kuò)散2.5 h，最后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，測量抑菌圈的直徑，評價(jià)發(fā)酵上清液的pH敏感性，重復(fù)3次。

1.2.8 排除酸的抑制作用[9]

用濃度為1 mol/L的NaOH將發(fā)酵上清液pH調(diào)至7，以未處理的發(fā)酵上清液作對照，各取200 μL分別加入到指示菌平板上的牛津杯中，蓋上陶瓦蓋，4℃條件下擴(kuò)散2.5 h，最后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，測量抑菌圈的直徑，反映抑菌能力的強(qiáng)弱，以此排除上清液中的酸抑制作用，重復(fù)3次。

1.2.9 排除過氧化氫的干擾[10]

取200 μL待測菌株的發(fā)酵上清液，于80℃保溫10 min，以未處理的發(fā)酵上清液作對照，分別加入到指示菌平板上的牛津杯中，蓋上陶瓦蓋，4℃條件下擴(kuò)散2.5 h，最后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，測量抑菌圈的直徑，反映抑菌能力的強(qiáng)弱，以此排除發(fā)酵上清液中過氧化氫的干擾，重復(fù)3次。

1.2.10 發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)蛋白質(zhì)特性的確定

將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分別溶解在濃度為50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7)中配成母液，分別加入到20 mL發(fā)酵上清液中，使其最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在37℃水浴中溫浴2 h后取出，加熱10 min進(jìn)行滅酶活處理，將pH調(diào)到與初始發(fā)酵上清液相同的值，以用磷酸緩沖液稀釋相同倍數(shù)后的發(fā)酵上清液作對照，各取200 μL分別加入到指示菌平板上的牛津杯中，蓋上陶瓦蓋，4℃條件下擴(kuò)散2.5 h，最后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，測量抑菌圈的直徑，評估抑菌能力的大小，以期反映乳酸菌發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)對各種蛋白酶的敏感性，確定其蛋白質(zhì)特性，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

從所取樣品中初篩到5株能產(chǎn)生CaCO3溶解圈的乳酸菌，將其標(biāo)為A1、A2、A3、A4和A5。菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果如表1所示，菌株均為G+。具有較高活性的菌株在平板上能較快地形成透明圈，從表2得知，菌株A5透明圈直徑和菌落直徑的比值最大，過氧化氫測試為陰性，同時(shí)能在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試平板上形成抑菌圈，故將其作為實(shí)驗(yàn)菌株。

2.2 菌株的部分生理生化特性及鑒定

2.2.1 菌株的部分生理生化特性

菌株A5為兼性厭氧菌，部分生理生化特性：淀粉水解呈陰性，運(yùn)動性、革蘭染色、明膠液化、甲基紅實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵和纖維素分解呈陽性。

表1 5株乳酸菌的菌落特征及革蘭氏染色結(jié)果Table 1 Characteristics of colony and gram staining of 5 LAB strains

表2 5株乳酸菌透明圈直徑、菌落直徑及其比值Table 2 Diameter of clear circle, colony and their ratio of 5 LAB strains

2.2.2 乳酸菌的鑒定

將菌株A5接種到5～10 mL的石蕊牛奶培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，石蕊被還原為無色，牛奶呈正常凝固現(xiàn)象，培養(yǎng)基上層表面有紫紅色環(huán)，鑒定其為乳酸菌。將菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，序列長度為1472 bp，如圖1。

圖1 菌株A5的16S rDNA擴(kuò)增序列Fig 1 16S rDNA sequence of strain A5

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

菌株A5的16S rDNA基因序列，通過GenBank中核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)相似度達(dá)99%，表明該菌屬于鼠李糖乳桿菌屬，暫命名為Lactobacillusrhamnosussp.A5，簡稱為A5。選取相似度高的13個(gè)近源乳桿菌的16S rDNA序列，經(jīng)多重序列對比，用軟件MAGE 5.0按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(見圖2)該菌與鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosusstrain JCM 1136同源性最高，相似度為99%。

圖2 A5的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 2 Phylogenetic tree of strain A5 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株生長曲線

由圖3可以看出，菌株的延遲期為0～6 h，這是由于細(xì)菌進(jìn)入新的培養(yǎng)條件，需要一個(gè)適應(yīng)環(huán)境的時(shí)間，不會立即繁殖，此時(shí)菌體的代謝機(jī)能非?；钴S，誘導(dǎo)酶類形成得很快；對數(shù)生長期為6～16 h，細(xì)菌開始生長繁殖，生長速率迅速增加達(dá)最大值，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間呈直線函數(shù)關(guān)系；16 h以后屬于穩(wěn)定期，隨著微生物的迅速生長繁殖，營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，菌體的生長速度下降，此期內(nèi)細(xì)胞的生長速率與死亡速率達(dá)到動態(tài)平衡，細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最大值；在穩(wěn)定期的末期，由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)幾乎耗盡，細(xì)胞死亡速率增加而使細(xì)胞數(shù)量顯著下降，從而進(jìn)入衰亡期。

2.4 發(fā)酵上清液的pH敏感性

將菌株A5發(fā)酵上清液調(diào)節(jié)至不同pH，通過牛津杯法測定抑菌圈直徑的大小，結(jié)果如表3所示。在pH為2～5條件下抑菌圈直徑較大，隨著pH升高，發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑逐漸下降，當(dāng)pH為8時(shí)，幾乎未形成抑菌圈。這說明菌株A5所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在酸性或弱酸性條件下穩(wěn)定，能保持較高的抑菌活性。在高pH下抑菌活性丟失，可能是由于pH變化會使抑菌物質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起抑菌活性降低甚至消失。

圖3 菌株A5的生長曲線Fig 3 The growth curve of strain A5

表3 不同pH條件下抑菌圈的直徑Table 3 Diameter of inhibitory circle of supernatant under different pH value

“-”表示無抑菌圈產(chǎn)生

2.5 排除酸的抑制作用

用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為指示菌，將實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵上清液pH調(diào)至7，以發(fā)酵上清液為對照，通過牛津杯法測定抑菌圈大小。如表4所示，對照組的抑菌圈直徑大于實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑，說明乳酸菌的發(fā)酵上清液中，有機(jī)酸也有抑菌作用，但排除酸作用后，上清發(fā)酵液中仍然存在另外的抑菌物質(zhì)。

2.6 排除過氧化氫的抑制作用

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為指示菌，以處理的發(fā)酵上清液(80℃保溫10 min)為實(shí)驗(yàn)組，未處理的發(fā)酵上清液為對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過牛津杯法測定抑菌圈大小。結(jié)果(如表5)顯示，對照組的抑菌圈直徑大于實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑，說明乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物中H2O2也有抑菌活性，但將H2O2去除后，發(fā)酵液仍然有抑菌活性，說明其中還存在其他的抑菌物質(zhì)。

表4 發(fā)酵上清液、pH調(diào)整為7的發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑Table 4 Diameter of inhibitory circle of supernatant and supernatant adjusted pH to 7

表5 發(fā)酵上清液和80℃保溫處理的發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑Table 5 Diameter of inhibitory circle of supernatant and supernatant treated by heating

2.7 發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)蛋白質(zhì)特性的確定

用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為指示菌，以用不同蛋白酶分別處理的發(fā)酵上清液為實(shí)驗(yàn)組，未處理的發(fā)酵上清液為對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過牛津杯法測定抑菌圈大小。結(jié)果(如表6)顯示，對照組的抑菌圈直徑大于實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑，說明乳酸菌的發(fā)酵上清液經(jīng)過胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后，抑菌效果減弱，表明發(fā)酵產(chǎn)物中存在一類對蛋白酶敏感的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，該物質(zhì)對發(fā)酵上清液的抑菌效果起主要作用。

表6 蛋白酶處理后發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑Table 6 Diameter of inhibitory circle of supernatant treated by proteinase

3 討論

目前已報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌有LGG(LactobacillusrhamnosusGG)、ZJ19[11]及KCA386[12]，對李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌和多數(shù)乳酸菌有抑制作用，但對常見致病菌如金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌的抑制作用較弱，限制其在食品防腐保鮮加工業(yè)中的應(yīng)用。與LGG所產(chǎn)細(xì)菌素相比，菌株A5所產(chǎn)細(xì)菌素具有較廣的抑菌譜，其所產(chǎn)蛋白質(zhì)類抑菌物質(zhì)對常見的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等致病菌、腐敗菌均有較好的抑制效果，使其在食品防腐保鮮加工業(yè)中的廣泛應(yīng)用成為可能。

本文從泡菜中篩出一株抑菌效果較好的乳酸菌，通過酸排除實(shí)驗(yàn)、過氧化氫排除實(shí)驗(yàn)和酶敏感實(shí)驗(yàn)確定該菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)除有機(jī)酸、過氧化氫等，還有一種蛋白質(zhì)類物質(zhì)，即細(xì)菌素。對其抑菌特性研究顯示：乳酸菌株A5所產(chǎn)細(xì)菌素具有較好的耐酸性，在pH 2～5時(shí)都有較好的抑菌活性，在pH 2時(shí)仍保持穩(wěn)定的抑菌活性，具有與人體腸道特征相符合的酶敏感性。

4 小結(jié)

采用分子生物學(xué)手段對菌株A5進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，得到1472 bp的基因序列，同GenBank中核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對后，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)相似度達(dá)99%，確定該菌株屬于鼠李糖乳桿菌屬，并將其暫命名為Lactobacillusrhamnosussp.A5。該菌株所產(chǎn)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)可被蛋白酶降解而不會在體內(nèi)殘留，具有較高的安全性，在抑制各種病原菌和防止食品腐敗等方面具有重要意義。后期的研究，需要分離純化到菌株A5所產(chǎn)抑菌物質(zhì)(細(xì)菌素)，并對其生物學(xué)活性和安全性進(jìn)行充分評估，以期開發(fā)出新型的天然防腐劑。

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