李雙彤，張秋芳，周陽靖，唐方園，程軍蕊，鄭琦宏，徐繼榮

(1.寧波大學(xué) 建筑工程與環(huán)境學(xué)院，寧波 315211； 2． 泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，泉州 362000； 3.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泉州 362000)

位于河流與海水交匯處的河口生態(tài)系統(tǒng)，是陸源污染物重要排放口，極易因人類活動(dòng)導(dǎo)致富營養(yǎng)化而引發(fā)赤潮等環(huán)境問題[1-2]。杭州灣地處錢塘江入?？冢瑫r(shí)也是上海、杭州、寧波三大都市幾何中心，但近年來由于周邊城市工業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，大量營養(yǎng)鹽輸入后會(huì)隨懸浮泥沙沉積在沿岸潮灘沉積物中，形成了各種營養(yǎng)鹽的蓄積庫[3]。與國內(nèi)典型河口和沿岸潮灘相比，該地區(qū)總氮和總磷已處于較高水平，屬于嚴(yán)重富營養(yǎng)化狀態(tài)[4-5]，且東海水域潮汐、泥沙和鹽度以及人類活動(dòng)等復(fù)雜多變的因素[6]都導(dǎo)致該區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)變得更為脆弱。因此，杭州灣入?？谏鷳B(tài)環(huán)境正面臨著巨大挑戰(zhàn)。

微生物是生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分，對(duì)維持河口生物地球化學(xué)循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)平衡起著重要作用，其多樣性可以作為評(píng)估河口生態(tài)系統(tǒng)重要生物學(xué)指標(biāo)[7]。然而，作為杭州入海口生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分的微生物，其多樣性及與環(huán)境的相關(guān)關(guān)系等研究迄今為止還很匱乏。與傳統(tǒng)方法(DGGE和T-RFLP等)相比，高通量測序(HTS)技術(shù)可用于分析豐度較低和復(fù)雜的微生物群落[8]，該方法具快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性分析中。

因此，為探明杭州灣入海口生態(tài)系統(tǒng)原核生物多樣性及其與環(huán)境因子相關(guān)關(guān)系，本研究擬通過新一代測序平臺(tái)Illumina，分析河口沉積物總DNA中16S rRNA基因序列，并將其多樣性與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析，了解近海水域微生物分布特征與碳、氮、磷和重金屬等環(huán)境因子互作關(guān)系，為杭州灣入?？诃h(huán)境質(zhì)量監(jiān)控提供參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2013年7月20—23日，應(yīng)用GPS定位系統(tǒng)采集了杭州灣入海口南北兩岸和內(nèi)海3個(gè)區(qū)域共13個(gè)點(diǎn)位(詳見圖1和表1)沉積物樣品。其中，1)杭州灣北岸：金山工業(yè)區(qū)排污口上游(HZW1)和上游(HZW2)、海鹽縣(HZW3)、洋山港碼頭(HZW10)；2)杭州灣南岸：上虞工業(yè)區(qū)排污口上游距排污口約1 km處(HZW4)、排污口(HZW5)和排污口下游距排污口2 km處(HZW6)，杭州灣濕地保護(hù)區(qū)內(nèi)距中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所北部方向200 m處(HZW7)、新浦鎮(zhèn)海灘距防洪堤1.5 km(HZW8)和鎮(zhèn)海舟山橋頭灘涂(HZW9)；3)距南北兩岸較遠(yuǎn)處的內(nèi)海3個(gè)點(diǎn)位：HZW11、HZW12和HZW13。

在每個(gè)采樣點(diǎn)用掘式采樣器采集距沉積物表面0～10 cm 處的沉積物，混勻后，分成兩部分，一部分裝入無菌采樣袋密封后置液氮罐冷凍保存，然后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室凍干后，過1 mm篩，于-80℃下保存，用于提取總DNA；另一部分自然風(fēng)干后用于理化指標(biāo)分析。

表1 采樣點(diǎn)Table 1 Sampling sites

圖1杭州灣入海口沉積物采樣點(diǎn)
Fig 1 Sampling sites in Hangzhou Bay

1.2 理化性狀分析

1.3 總DNA提取

稱取凍干后沉積物樣品0.50 g，采用FastDNA Spin Kit For Soil(Qbiogene公司，美國)試劑盒，應(yīng)用核酸提取儀(Qbiogene公司，美國)提取，均質(zhì)條件為40 s和6.0 m/s，提取步驟參照說明書進(jìn)行。將獲得的總DNA用70 μL DES溶液收集，用Nonadrop-1000超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量和純度測定后，儲(chǔ)存于-80℃下備用。

1.4 PCR擴(kuò)增及高通量測序

用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′[11]對(duì)提取到的DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min； 95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸1 min。PCR儀為ABI Geneamp? 9700型。在Illumina Miseq平臺(tái)上測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Flash[12]軟件將除引物和barcode后的PE-reads拼接成一條序列，再通過QIIME v.1.7.0(Quantitative insights into microbial ecology, )軟件將對(duì)其進(jìn)行過濾和分析[13]。然后用Uclust軟件[14]對(duì)序列進(jìn)行聚類，將相似性大于97%的序列歸為同一OTU(Operational Taxonomic Unit)。把每個(gè)OTU序列提取出來并用RDP(Ribosomal Database Project)Classifier軟件[15]和SILVA數(shù)據(jù)庫[16]對(duì)序列的分類信息進(jìn)行注釋。利用Mothur v1.30.1軟件對(duì)相似水平高于97%以上OTUs進(jìn)行α-多樣性分析，包括了評(píng)估物種總數(shù)(Chao1)、每個(gè)樣本OTUs數(shù)量(Observed species)和物種多樣性(Shannon-Wiener)3個(gè)指數(shù)。應(yīng)用SPSS19.0軟件計(jì)算出相對(duì)豐度>1%優(yōu)勢菌群與環(huán)境因子的相關(guān)性(Pearson系數(shù))，運(yùn)用R軟件繪制相關(guān)性熱圖(Heatmap)，直觀地表征原核生物多樣性與環(huán)境因子相關(guān)關(guān)系。

高通量測序所獲得的數(shù)據(jù)已收錄于NCBI的Sequences Read Archive(SRA)，登錄號(hào)為SRP096130。

2 結(jié)果

2.1 沉積物理化指標(biāo)

圖2 采樣點(diǎn)與環(huán)境理化因子的主成分分析圖Fig 2 PCA ordination graph for the sampling site of patterns and environmental factors

表2 沉積物樣品主要理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of sediment samples

2.2 原核生物群落多樣性

將長度過短和有潛在錯(cuò)誤的序列經(jīng)篩選刪去后，在HZW1～HZW13中分別得到了41 351、34 263、39 716、39 915、29 904、36 632、44 321、33 205、33 878、40 884、33 346、43 798和35 419條序列。將相似度>97%序列進(jìn)行聚類，共得到15 656個(gè)OTU。

α多樣性分析結(jié)果如表3所示，Observed species最大的是HZW6，其次是HZW9和HZW11；HZW2的Shannon-Wiener指數(shù)最大，其物種多樣性最高，其次是HZW5和HZW6。Chao1指數(shù)中，最高的是HZW2，其次是HZW3和HZW5。

表3 基于97%相似度的α多樣性分析Table 3 α-diversity analysis based on 97% similarity

按照眾數(shù)原則，利用RDP對(duì)15 656個(gè)OTU進(jìn)行注釋，共有65個(gè)門、210個(gè)綱、419個(gè)目、688個(gè)科和1118個(gè)屬。由于菌門較多，本研究只選取了相對(duì)豐度>1%的菌門，在堆積柱狀圖上做了圖例。結(jié)果如圖3所示，共有19個(gè)相對(duì)豐度>1%的菌門(綱)。13個(gè)樣品中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢菌門均為變形菌，HZW10中變形菌相對(duì)豐度最高，而HZW12中變形菌相對(duì)豐度最低。因?yàn)槊總€(gè)樣品中變形菌門相對(duì)豐度都很高(相對(duì)豐度均>30%)，所以在柱狀圖上以變形菌門下相對(duì)豐度>1%的α、β、γ和δ變形菌綱進(jìn)行展示。

在科水平下，13個(gè)樣品中除了HZW4、HZW5、HZW6和HZW7之外，優(yōu)勢菌均為魚立克次體(Piscirickettsiaceae)，其平均相對(duì)豐度為8.4%。HZW4的優(yōu)勢菌為地桿菌(Geobacteraceae，6.4%)，HZW5的優(yōu)勢菌為叢毛單胞菌(Comamonadaceae，3.6%)，HZW6的優(yōu)勢菌為(Comamonadaceae，2.5%)，HZW7的優(yōu)勢菌為不動(dòng)細(xì)菌(Acinetobacter，13.8%)。

2.3 原核生物群落與環(huán)境因子關(guān)系

菌群豐度與環(huán)境因子相關(guān)性用Pearson系數(shù)表示，若基小于0.05，則認(rèn)為兩者顯著相關(guān)；Pearson系數(shù)若為正的，則表示兩者之間呈正相關(guān)，以紅色表示；Pearson系數(shù)若為負(fù)的，則表示兩者呈負(fù)相關(guān)，以藍(lán)色表示。

3 討論

α多樣性是反映物種多樣性的重要指標(biāo)，通過高通量測序?qū)贾轂橙牒？诔练e物中原核生物群落多樣性分析結(jié)果表明Shannon-Wiener指數(shù)達(dá)9.72，Chao1指數(shù)達(dá)997，OTU總數(shù)達(dá)到15 656，這些指數(shù)均遠(yuǎn)高于應(yīng)用PCR-DGGE和T-RFLP等傳統(tǒng)方法研究近岸海域沉積物所獲得的結(jié)果[17-18]，說明了高靈敏度的高通量測序方法能夠更準(zhǔn)確地反映出環(huán)境中原核生物群落多樣性特征。

本研究對(duì)杭州灣南北兩岸以及內(nèi)海部分區(qū)域和洋山港進(jìn)行了海水表層沉積物原核生物多樣性分析，共發(fā)現(xiàn)了65個(gè)菌門，且優(yōu)勢菌都是變形菌，而變形菌門下的優(yōu)勢菌有α、β、γ和δ變形菌，這與孟加拉灣深海[19]和日本沖繩縣伊平屋島北部海洋[20]的沉積物所獲得結(jié)果相類似。3個(gè)(HZW11、HZW12和HZW13)內(nèi)海樣品中變形菌的豐度相對(duì)較小，而綠菌則相反。另外，南北岸微生物多樣性的差異可能是由于南北兩岸所處的地理位置不同而受海水的潮汐、溫度和環(huán)境污染物等因素綜合影響而導(dǎo)致的，尤其是不同工業(yè)區(qū)排放的污水雖經(jīng)處理，但是長期排放而累積于沉積物中不同污染物如重金屬等所形成的不同微生態(tài)環(huán)境可能會(huì)對(duì)原核生物的生長具有選擇性。此外，在海鹽縣秦山核電站附近采集的樣品(HZW3)群落結(jié)構(gòu)特征與鄰近HZW1和HZW2的較為相似，說明了核電站的附近灘涂中的微生物多樣性受其影響不明顯。

4 小結(jié)

綜上所述，通過高通量測序方法分析了杭州灣入?？谘匕逗蛢?nèi)海沉積物原核生物多樣性特征以及環(huán)境因子對(duì)其分布的影響，發(fā)現(xiàn)南北兩岸原核生物種類存在差異，金山工業(yè)區(qū)和上虞工業(yè)區(qū)排污口附近水域微生物多樣性也存在明顯不同，環(huán)境因子及累積的重金屬等對(duì)原核生物多樣性皆產(chǎn)生了重要的影響。

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