賀海濤，張洪濤，曲娟娟，郭進(jìn)，鄭明儀，蔣蕓，詹曉北

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

β-1,3-葡寡糖是一類聚合度在3～10左右的低聚β-1,3-葡聚糖[1]，在醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、農(nóng)業(yè)應(yīng)用、甚至在化妝品行業(yè)都得到廣泛應(yīng)用[2]。法國的Geomer公司成功生產(chǎn)出β-1,3-葡寡糖型的生物農(nóng)藥，其主要通過β-1,3-葡寡糖來激活植物免疫系統(tǒng)從而殺死致病的真菌[3]。此外，β-1,3-葡寡糖還具有抗病毒、抗過敏和調(diào)節(jié)免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能和潛力[4-5]。侯慶華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，β-1,3-葡寡糖可以對糖尿病睪丸的損傷起到修復(fù)作用，能夠提高糖尿病睪丸分泌睪酮的能力；HIDA等[7]研究發(fā)現(xiàn)，β-1,3-葡寡糖可誘導(dǎo)老鼠脾臟細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和干擾素-g(interferon-g，IFN-g)，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)；β-1,3-葡寡糖還可增加單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量而減少淋巴細(xì)胞的數(shù)量，并能刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子提高免疫能力等[8]。

目前β-1,3-葡寡糖的制備主要通過降解和合成兩個(gè)方向得到。降解方法主要通過酸解或酶解熱凝膠(一種線性的β-1,3-葡聚糖)來制備β-1,3-葡寡糖，由于熱凝膠不溶于水且在水解熱凝膠的過程中所生成的β-1,3-葡寡糖聚合度不可控，所以這一方法的使用具有一定的局限性。合成主要通過化學(xué)法和酶法，化學(xué)法合成步驟繁瑣，且其得到的寡糖難以用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域；而基于糖基轉(zhuǎn)移酶的酶法寡糖合成，雖然條件溫和，過程簡單，但卻需要昂貴的二磷酸尿苷葡糖(uridine diphosphate glucose, UDPG)作為前體物質(zhì)，因此，目前酶法合成β-1,3-葡寡糖的研究主要用于實(shí)驗(yàn)室中寡糖的微量合成。

昆布二糖磷酸化酶(laminaribiose phosphorylase，LPase)也叫海帶二糖磷酸化酶，是一種催化特異的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于眼蟲綱的原生動(dòng)物中，如Euglenagracilis或Astasiaocellate。且該酶可催化α-D-葡萄糖-1-磷酸(α-D-glucose-1-phosphate，G1P)與β-1,3-葡寡糖之間的可逆反應(yīng)：在G1P存在的條件下可利用葡萄糖或低聚合度β-1,3-葡寡糖作為引物合成更高聚合度β-1,3-葡寡糖[9]；在Pi存在的條件下可磷酸解高聚合度的β-1,3-葡寡糖生成低聚合度的β-1,3-葡寡糖和G1P[10]。

蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase，SPase)也是一種催化特異的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[11]。其可以將蔗糖中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移至受體生成G1P和果糖。蔗糖磷酸化酶主要分布在細(xì)菌等微生物中，少量植物中也含有該酶?，F(xiàn)生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶的主要菌株有腸膜明串菌株(Leuconostocmesenteroides)[12]、嗜糖假單胞菌(Pseudomonassaccharophila)[13]、變異鏈球菌(Streptococcusmutans)[14]、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)[15]、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)[16]等。

KITAOKA等[17]通過蔗糖磷酸化酶、木糖異構(gòu)酶和昆布二糖磷酸化酶催化合成昆布二糖，但是對更高聚合度的β-1,3-葡寡糖的合成并沒有進(jìn)行詳細(xì)的研究，對反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物聚合度之間的關(guān)系也沒有進(jìn)行探索。所以本文在其研究的基礎(chǔ)上通過蔗糖磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶粗酶液，以價(jià)格低廉的蔗糖和葡萄糖為初始原料，進(jìn)行耦合催化生成β-1,3-葡寡糖(其耦合反應(yīng)過程如圖1所示)，并研究催化反應(yīng)的時(shí)間與產(chǎn)物聚合度的關(guān)系，為后續(xù)通過控制催化反應(yīng)的時(shí)間來得到不同聚合度的寡糖提供理論指導(dǎo)。與以往的酶法合成相比，該法合成過程不需要昂貴的前體物質(zhì)UDPG、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)和輔酶等，只需價(jià)格低廉的蔗糖和引物葡萄糖，且反應(yīng)以纖細(xì)眼蟲的細(xì)胞破碎液中昆布二糖磷酸化酶的粗酶液進(jìn)行反應(yīng)，因此大大降低了生產(chǎn)成本，容易實(shí)現(xiàn)β-1,3-葡寡糖的大規(guī)模、廉價(jià)合成。

圖1 β-1,3-葡寡糖的合成策略Fig.1 Reaction scheme for synthesis of β-1,3-glucooligo-saccharides

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

纖細(xì)眼蟲(Euglenagracilisstrain Z SAG G?ttingen 1224-5/25)，購于德國哥延根大學(xué)藻類菌種保藏中心，現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室。

蔗糖磷酸化酶S0937，SIGMA-ALDRICH公司；α-D-葡萄糖-1-磷酸二鈉(G1P)，Alfa Aesar公司；葡萄糖、蔗糖、氫氧化鈉、氯化鎂、鉬酸銨、抗壞血酸等(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15型冷凍高速離心機(jī)，美國Sigma公司；LEICA S系列普通光學(xué)顯微鏡，德國徠卡公司；UV-1800型普通光學(xué)顯微鏡，上海精密儀器儀表有限公司；LC-1200型高效液相色譜，美國Agilent公司；UltrafleXtreme型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，美國布魯克·道爾頓公司；ThermoFisher LCQ fleet型電噴霧質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Seientific公司；Varian Unity Inova 600型核磁共振儀，美國瓦里安公司。

1.3 方法

1.3.1 纖細(xì)眼蟲的培養(yǎng)[18]

種子培養(yǎng)基(g/L)：醋酸鈉1.0，牛肉膏1.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏2.0。土壤浸出液體積分?jǐn)?shù)為3%，25 ℃，120 r/min，12 h避光12 h見光(25 μmol/(m2·s))培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.0，維生素B1210-6，葡萄糖15。30 ℃，120 r/min避光培養(yǎng)。

1.3.2 昆布二糖磷酸化酶粗酶液的制備及酶活測定

將培養(yǎng)5 d的種子按照5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，避光培養(yǎng)9 d，之后離心收集纖細(xì)眼蟲細(xì)胞并懸浮于10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中(pH 7.2)，超聲波破碎細(xì)胞，12 000×g離心30 min，收集離心上清液作為昆布二糖磷酸化酶的粗酶液。此操作在4 ℃條件下進(jìn)行。

收集離心上清液做酶活性分析，酶活的測定參照KITAOKA的方法[10]，即每分鐘催化反應(yīng)生成1 μmol的Pi所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位。Pi的測定采用SAHEKI的方法[19]，蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[20]。其結(jié)果如表1所示，將收集的粗酶液冷凍干燥，濃縮之后用于下一步合成反應(yīng)。

表1 Euglena gracilis發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞密度及培養(yǎng)基中昆布二糖磷酸化酶粗酶液酶活Table 1 The cell density of Euglena gracilis and the activityof laminarinase phosphorylase

1.3.3 昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化合成β-1,3-葡寡糖

酶催化反應(yīng)體系：50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)，100 mmol/L的G1P，5 mmol/L的MgCl2，50 mmol/L的葡萄糖[21]，之后加入一定量的昆布二糖磷酸化酶粗酶液(0.1 U/mL)進(jìn)行酶催化合成反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間0.5、4、12、24 h，以反應(yīng)0 h作為對照組，之后經(jīng)過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析產(chǎn)物寡糖的聚合度分布。

1.3.4 昆布二糖磷酸化酶粗酶液和蔗糖磷酸化酶耦合催化合成β-1,3-葡寡糖

反應(yīng)體系如下：100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0)、100 mmol/L的蔗糖、50 mmol/L的葡萄糖、5 mmol/L的MgCl2[21]，之后加入蔗糖磷酸化酶(0.2 U/mL)[22]和昆布二糖磷酸化酶粗酶液(0.1 U/mL)，37 ℃反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間0.5、1、4、12、24 h，以反應(yīng)0 h作為對照組，之后經(jīng)過MALDI-TOF-MS分析產(chǎn)物寡糖的聚合度分布。

1.3.5 生成產(chǎn)物的分離純化

(1)G1P的去除：將1.3.3已沸水浴的不同時(shí)間段的樣品混合后冷凍干燥，之后加水稀釋至1 mL，并過0.22 μm的水系膜，將樣品加樣于C18固相萃取柱中，此時(shí)濾出來的即為反應(yīng)殘留的G1P。再加入3 mL的去離子水進(jìn)行洗柱并收集，此時(shí)收集的即為反應(yīng)所生成的β-1,3-葡寡糖。按照相同的方法處理1.3.4中反應(yīng)液。

(2)鹽和單糖的去除：將上述收集的2管寡糖溶液分別加樣于200 mg級的石墨化碳固相萃取柱中，之后各自加入6 mL的去離子水，此時(shí)流出的為鹽和單糖的水溶液。待石墨化碳柱下方?jīng)]有液體流出時(shí)再各自依次加入6 mL 體積分?jǐn)?shù)為25%、50%和75%的乙腈進(jìn)行梯度洗脫，此時(shí)收集流出的樣品，每管收集的樣品即為已去鹽和去單糖的不同聚合度范圍的β-1,3-葡寡糖，之后將收集的樣品冷凍干燥之后用于后續(xù)電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS/MS)和氫核磁共振(hydrogen nuclear magnetic resonance，1H-NMR)分析。

1.3.6 昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化葡萄糖和G1P合成β-1,3-葡寡糖的優(yōu)化

KITAOKA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，昆布二糖磷酸化酶在45 ℃條件下保存30 min依然具有一定的酶活。TAKANORI等[23]從萊氏無膽甾原體(Acholeplasmalaidlawii)中克隆表達(dá)了昆布二糖磷酸化酶，其在pH 5.0以上具有較高的酶活。因此本研究選擇pH 7.2，37 ℃為酶催化最適的條件[10]，在此條件下優(yōu)化昆布二糖磷酸化酶、G1P和葡萄糖的添加量，從而得到最適的生成β-1,3-葡寡糖的催化條件。由于消耗1分子的G1P即生成1分子的Pi，所以可以通過測定反應(yīng)體系中Pi的生成量來表示G1P的消耗量，可作為反應(yīng)進(jìn)程的指標(biāo)[19]。

1.3.7 耦合催化反應(yīng)體系的優(yōu)化

在1.3.6優(yōu)化的最適條件下引入蔗糖磷酸化酶，雙酶耦合催化生成β-1,3-葡寡糖。李恬[22]等研究發(fā)現(xiàn)用蔗糖磷酸化酶催化蔗糖產(chǎn)G1P的最適條件為100 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.5)、蔗糖濃度100 mmol/L、溫度40 ℃、蔗糖磷酸化酶4.5 U/L、反應(yīng)4 h，此時(shí)G1P的得率可達(dá)76.9%。綜合考慮1.3.6中昆布二糖磷酸化酶優(yōu)化結(jié)果，本文選用100 mmol/L磷酸緩沖液、100 mmol/L的蔗糖、50 mmol/L的葡萄糖、5 mmol/L的MgCl2、蔗糖磷酸化酶(0.2 U/mL)，昆布二糖磷酸化酶粗酶液(0.1 U/mL)為基本的反應(yīng)條件，在此基礎(chǔ)上對雙酶耦合催化的pH值、溫度進(jìn)行優(yōu)化。此時(shí)蔗糖磷酸化酶催化蔗糖生成G1P和果糖，且G1P通過昆布二糖磷酸化酶和葡萄糖反應(yīng)生成β-1,3-葡寡糖，由于G1P作為整個(gè)反應(yīng)體系的中間產(chǎn)物不斷產(chǎn)生和消耗，因此難以監(jiān)測，本文通過測定葡萄糖的轉(zhuǎn)化率作為整體反應(yīng)進(jìn)程的指標(biāo)。按公式(1)計(jì)算。

(1)

式(1)中：A為殘余的葡萄糖的濃度，mmol/L；B為葡萄糖的初始濃度，mmol/L。

葡萄糖濃度可通過高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測定，色譜柱Click XAmide(4.6 mm×250 mm);RI檢測器；流動(dòng)相V(乙腈)∶V(水)=85∶15；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 以葡萄糖和G1P為底物時(shí)昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化反應(yīng)產(chǎn)物的分析

考慮到雙酶耦合催化合成β-1,3-葡寡糖的復(fù)雜性，首先用G1P來驗(yàn)證昆布二糖磷酸化酶合成寡糖的聚合度特征。目前主要用MALDI-TOF-MS進(jìn)行寡糖聚合度分析，該方法具有靈敏度強(qiáng)、分辨率高、測量范圍廣等特點(diǎn)[24]。對1.3.3中反應(yīng)0、0.5、4、12、24 h的產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，結(jié)果如圖2所示。反應(yīng)0.5 h時(shí)，產(chǎn)物的聚合度最高只到4；當(dāng)反應(yīng)4 h時(shí)，產(chǎn)物的聚合度范圍為4～10，即隨著反應(yīng)時(shí)間的增加有更高聚合度的寡糖生成；當(dāng)反應(yīng)12 h時(shí)，產(chǎn)物聚合度范圍則變?yōu)?～8，即反應(yīng)12 h時(shí)生成的寡糖的聚合度并沒有增加反而有所下降。推測這是由于隨著合成反應(yīng)的進(jìn)行，體系中會(huì)伴隨著大量游離磷的生成。游離磷的大量積累導(dǎo)致反應(yīng)并不能繼續(xù)向合成方向進(jìn)行，而促進(jìn)反應(yīng)向著磷酸解的方向進(jìn)行，這就使得之前合成的高聚合度寡糖磷酸解成低聚合度的寡糖和G1P。通過上述分析可知昆布二糖磷酸化酶粗酶液可催化G1P和葡萄糖反應(yīng)合成不同聚合度的寡糖，并且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，合成寡糖的聚合度降低，最終出現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡現(xiàn)象。所以可以通過控制反應(yīng)時(shí)間得到一定聚合度范圍的β-1,3-葡寡糖。

圖2 昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS分析Fig.2 MALDI-TOF-MS specturm of the reaction products catalyzed by Laminaribiose phosphorylase

采用MALDI-TOF-MS分析僅僅可以得到寡糖的聚合度分布，而ESI-MS/MS已經(jīng)成為解析寡糖糖鏈組成的高效工具[25]，又由于1H-NMR能夠提供α-或β-異頭碳的構(gòu)型信息[26]，所以本文利用ESI-MS/MS和1H-NMR對昆布二糖磷酸化酶合成的寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。以葡萄糖和G1P為底物，利用昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化合成β-1,3-葡寡糖，經(jīng)過石墨化碳柱純化后，對乙腈體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)洗脫出來的樣品進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)、ESI-MS/MS和1H-NMR分析，分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-MS、ESI-MS/MS和1H-NMR分析Fig.3 ESI-MS，ESI-MS/MS and 1H-NMR specturm of the reaction products catalyzed by Laminaribiose phosphorylase

從圖3-a中可以看出，在負(fù)離子模式下昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-MS結(jié)果顯示m/z為341.1、503.1和665.2的峰，相對應(yīng)的聚合度為2、3和4[27]。對于產(chǎn)物中聚合度為3的寡糖進(jìn)行ESI-MS/MS分析，所測得的產(chǎn)物寡糖的碎片峰如圖3-b所示，其質(zhì)譜碎片峰中主要是C型離子峰：C2(m/z341)、C1(m/z179)，僅在末端出現(xiàn)B型離子峰：B1(m/z161)，這與1,3-鍵連接的葡寡糖的碎片峰的特性相同，這表明昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化葡萄糖和G1P的反應(yīng)產(chǎn)物為1,3-鍵連接的葡寡糖[25]。從圖3-c中可以看出，產(chǎn)物寡糖的異頭氫的化學(xué)位移出現(xiàn)δ4.5～5.0之間，而大多數(shù)的α-端基質(zhì)子化學(xué)位移出現(xiàn)δ5～6之間，β-端基質(zhì)子化學(xué)位移出現(xiàn)δ4～5之間，所以可知產(chǎn)物寡糖的立體構(gòu)型為β-構(gòu)型，即昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化G1P和葡萄糖反應(yīng)所生成的寡糖為β-1,3-葡寡糖。

2.2 以葡萄糖和蔗糖為底物時(shí)雙酶耦合催化反應(yīng)產(chǎn)物的分析

研究結(jié)果表明，昆布二糖磷酸化酶可以利用葡萄糖和G1P實(shí)現(xiàn)寡糖的合成，但是G1P價(jià)格昂貴，所以用成品G1P作為反應(yīng)底物合成β-1,3-葡寡糖所需成本較高，不利于大規(guī)模合成β-1,3-葡寡糖。由于蔗糖磷酸化酶在Pi存在的條件下可以將1分子的蔗糖磷酸解生成1分子G1P和1分子果糖，因此，通過以蔗糖和葡萄糖為底物，用蔗糖磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶雙酶耦合催化實(shí)現(xiàn)β-1,3-葡寡糖的廉價(jià)合成：(1)蔗糖磷酸化酶將蔗糖拆分為G1P和果糖；(2)昆布二糖磷酸化酶利用前者生成的G1P實(shí)現(xiàn)糖鏈聚合度的增加，并解離出游離磷；(3)解離下來的游離磷繼續(xù)參與蔗糖磷酸化酶磷酸解蔗糖生成G1P。這樣通過循環(huán)反應(yīng)不僅大大提高了磷的利用率，同時(shí)減少了產(chǎn)物積累對反應(yīng)的抑制作用。

對1.3.4中反應(yīng)0、0.5、1、4、12和24 h的產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 耦合催化反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS分析Fig.4 MALDI-TOF-MS specturm of the reaction products catalyzed by mixed enzymes

可以看出，0 h時(shí)，沒有產(chǎn)物寡糖出現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間延長到0.5 h時(shí)，開始有4糖、5糖和6糖生成，反應(yīng)1 h時(shí)7糖、8糖開始出現(xiàn)。值得注意的是：添加到反應(yīng)體系中的蔗糖的峰信號強(qiáng)度在不斷地減弱，說明蔗糖正被磷酸解生成G1P。反應(yīng)4 h時(shí)，9糖、10糖和11糖開始出現(xiàn)，而當(dāng)接著增加反應(yīng)時(shí)間時(shí)并沒有更高聚合度的寡糖生成且產(chǎn)物寡糖的聚合度也沒有降低，推測耦合催化循環(huán)反應(yīng)達(dá)到了一個(gè)平衡的狀態(tài)。以上結(jié)果表明，以蔗糖為G1P的提供者，用蔗糖磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶來催化葡萄糖合成寡糖時(shí)，隨著時(shí)間的延長，最后寡糖的合成達(dá)到平衡，并不會(huì)出現(xiàn)高聚合度的寡糖被降解的現(xiàn)象。因此，通過蔗糖磷酸化酶催化蔗糖生成G1P來替代成品的G1P，并結(jié)合昆布二糖磷酸化酶完全可以實(shí)現(xiàn)寡糖的廉價(jià)合成。

為鑒定雙酶耦合催化合成的寡糖結(jié)構(gòu)，同樣對乙腈體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)洗脫出來的雙酶耦合催化樣品進(jìn)行ESI-MS、ESI-MS/MS和1H-NMR分析，分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 耦合催化反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-MS/MS、ESI-CID-MS/MS和1H-NMR分析Fig.5 ESI-MS，ESI-MS/MS and 1H-NMR specturm of the reaction products catalyzed by mixed enzymes

從圖5-a中可以看出，在負(fù)離子模式下耦合催化反應(yīng)產(chǎn)物的ESI-MS結(jié)果顯示m/z為341.1、503.2和665.2，分別對應(yīng)聚合度為2～4的葡萄糖單體的[M-H]-峰[27]。選擇寡糖產(chǎn)物中的3糖進(jìn)行ESI-MS/MS分析，所測得的產(chǎn)物寡糖的碎片峰如圖5-b所示。從圖5-b中可以看出，其質(zhì)譜碎片峰中同樣主要為C型離子峰：C2(m/z341)、C1(m/z179)，僅僅在末端出現(xiàn)B型離子峰：B1(m/z161)，這同樣與1,3-鍵連接的葡寡糖的碎片峰的特性相符[25]，這表明昆布二糖磷酸化酶粗酶液和蔗糖磷酸化酶耦合催化反應(yīng)寡糖產(chǎn)物為1,3-鍵連接的葡寡糖。從圖5-c中可以看出，產(chǎn)物寡糖的異頭氫的化學(xué)位移同樣出現(xiàn)δ 4.5～5.0之間，可知產(chǎn)物寡糖的立體構(gòu)型為β-構(gòu)型，即昆布二糖磷酸化酶粗酶液和蔗糖磷酸化酶耦合催化反應(yīng)所生成的寡糖同樣為β-1,3-葡寡糖。

2.3 昆布二糖磷酸化酶粗酶液催化合成β-1,3-葡寡糖反應(yīng)體系的優(yōu)化

在KITAOKA等[10]研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化昆布二糖磷酸化酶、G1P和葡萄糖的添加量，結(jié)果如圖6所示。

由圖6-a可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，G1P的消耗量在不斷的增加，酶濃度為0.01 U/mL和0.05 U/mL時(shí)，G1P的消耗量少，且G1P的消耗在4 h之前不斷增加，之后G1P的消耗量增加變緩；當(dāng)酶濃度為0.1 U/mL時(shí)，反應(yīng)2 h之后趨于穩(wěn)定，且此時(shí)消耗的G1P最多；當(dāng)酶濃度為0.5 U/mL和1.0 U/mL時(shí)，0.5 h之前反應(yīng)消耗的G1P達(dá)到最大，之后由于昆布二糖磷酸化酶催化的雙向性使得反應(yīng)向著磷酸解的方向進(jìn)行，反應(yīng)1 h之后趨于穩(wěn)定。綜合考慮G1P的消耗情況及2.1中反應(yīng)產(chǎn)物的聚合度分布情況選擇最適酶濃度為0.1 U/mL。

a-酶的添加量優(yōu)化；b-GIP添加量優(yōu)化；c-葡萄糖添加量優(yōu)化圖6 酶的添加量、G1P添加量和葡萄糖添加量對β-1,3-葡寡糖合成的影響Fig.6 The effect of enzyme、G1P and glucose dosage on the synthesis of β-1,3-glucooligosaccharides

在上述的最適昆布二糖酶添加量的條件下優(yōu)化G1P的添加量對催化合成β-1,3-葡寡糖的影響，結(jié)果如圖6-b所示。當(dāng)催化反應(yīng)1 h時(shí)，G1P添加量為25 mmol/L和50 mmol/L，反應(yīng)已趨于平衡，此時(shí)G1P的消耗量已不再增加；當(dāng)G1P添加量為75 mmol/L時(shí)，反應(yīng)2 h時(shí)G1P的消耗量達(dá)到最大；當(dāng)G1P的濃度達(dá)到100 mmol/L時(shí)，反應(yīng)4 h G1P的消耗量達(dá)到最大；接著增大G1P的濃度到125 mmol/L時(shí)，反應(yīng)4 h ，G1P的消耗量與100 mmol/L反應(yīng)4 h相比并沒有大幅的增加，且之后反應(yīng)都趨于平衡，綜合考慮反應(yīng)G1P的消耗量可知反應(yīng)的最適G1P的添加量為100 mmol/L。

在上述最適的酶的添加量和最適的G1P添加量的基礎(chǔ)上優(yōu)化葡萄糖的添加量對β-1,3-葡寡糖合成的影響，結(jié)果如圖6-c所示。當(dāng)葡萄糖添加量為5、10和30 mmol/L時(shí)，反應(yīng)4 h，G1P的消耗量都相對較低且4 h之后G1P的消耗量趨于平緩；當(dāng)葡萄糖的添加量為50 mmol/L時(shí)，反應(yīng)4 h，G1P的消耗量達(dá)到最大，且和75、100 mmol/L葡萄糖添加量反應(yīng)4 h相比，G1P的消耗量相差很小。通過葡萄糖添加量優(yōu)化的結(jié)果可知，當(dāng)G1P的添加量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葡萄糖的添加量時(shí)并沒有實(shí)現(xiàn)G1P的消耗量的大量增加。結(jié)合2.1中產(chǎn)物聚合度隨時(shí)間變化情況和上述的體系的優(yōu)化結(jié)果，昆布二糖磷酸化酶催化葡萄糖和G1P生成β-1,3-葡寡糖最適的反應(yīng)條件為0.1 U/mL的酶量、100 mmol/L的G1P、50 mmol/L的葡萄糖、pH 7.2、37 ℃反應(yīng)4 h，此時(shí)G1P的消耗量可達(dá)到42.7 mmol/L。

2.4 雙酶耦合催化法合成β-1,3-葡寡糖反應(yīng)體系的優(yōu)化

耦合催化反應(yīng)的溫度和緩沖液的pH既影響蔗糖磷酸化酶磷酸解蔗糖生成G1P，又影響昆布二糖磷酸化酶催化葡萄糖和G1P生成β-1,3-葡寡糖，因此選擇合適的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH是合成β-1,3-葡寡糖的關(guān)鍵。通過2.3中對昆布二糖催化葡萄糖和G1P生成β-1,3-葡寡糖反應(yīng)體系的優(yōu)化，得知在0.1 U/L的昆布二糖磷酸化酶添加條件下，最適的葡萄糖添加量為50 mmol/L，因此在進(jìn)行耦合催化的pH和溫度優(yōu)化時(shí)依舊考慮選擇昆布二糖磷酸化酶添加量為0.1 U/L及葡萄糖添加量為50mmol/L，再結(jié)合李恬[22]等對蔗糖磷酸化酶催化蔗糖產(chǎn)G1P的最適條件的研究，選擇100 mmol/L的蔗糖、50 mmol/L葡萄糖、0.1 U/mL昆布二糖磷酸化酶和0.2 U/mL 蔗糖磷酸化酶為基本反應(yīng)條件，反應(yīng)4 h來優(yōu)化耦合催化反應(yīng)的溫度和pH，結(jié)果如圖7所示。

a-pH優(yōu)化；b-溫度優(yōu)化圖7 pH和溫度對耦合催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 The influence of different pH and temperature on coupling catalysis

由圖7-a可知，隨著pH值的增大，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，且在pH 6.5～7.0之間保持較高的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)pH小于6.5時(shí)，耦合催化的化率呈直線增加的趨勢；當(dāng)pH為6.5時(shí)，耦合反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高；繼續(xù)增大pH時(shí)，耦合催化的轉(zhuǎn)化率明顯下降。因?yàn)檫^高的pH影響蔗糖磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶的酶活，從而影響耦合反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。

本文由此可以確定耦合反應(yīng)的最適pH為6.5，在此pH條件下葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為35.8%。溫度對耦合催化反應(yīng)同樣具有較大的影響，不同的溫度條件下耦合催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率也不同，選擇溫度梯度為25、33、37、40、43、45、50、60 ℃進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖7-b所示。

在35～45 ℃溫度范圍內(nèi)，耦合催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率保持在較高的水平，當(dāng)溫度低于37 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，耦合催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率呈線性增加；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，耦合催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大(39.4%)；當(dāng)溫度大于45 ℃時(shí)，耦合催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率迅速下降，這是由于高溫條件破壞了酶的結(jié)構(gòu)，使得酶失活。由此可知耦合催化反應(yīng)的最適溫度為40 ℃。結(jié)合2.2中耦合催化產(chǎn)物聚合度隨時(shí)間的變化情況及耦合催化反應(yīng)體系的優(yōu)化，生成β-1,3-葡寡糖最適的條件為100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)、100 mmol/L的蔗糖、50 mmol/L的葡萄糖、5 mmol/L的MgCl2、0.1 U/mL昆布二糖磷酸化酶、0.2 U/mL蔗糖磷酸化酶、40 ℃條件下反應(yīng)4 h，此時(shí)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)39.4%。

3 結(jié)論

綜上所述，E.gracilis中含有昆布二糖磷酸化酶且其細(xì)胞破碎液作為昆布二糖磷酸化酶的粗酶液可催化G1P和葡萄糖生成寡糖。在以上基礎(chǔ)上，可通過蔗糖磷酸化酶催化蔗糖生成G1P來供昆布二糖磷酸化酶催化反應(yīng)，生成寡糖。在本實(shí)驗(yàn)的條件下，我們發(fā)現(xiàn)耦合催化反應(yīng)0.5 h時(shí)合成寡糖聚合度在4～6之間；反應(yīng)4 h時(shí)，有7～11糖生成；4 h之后反應(yīng)趨于平衡，并無更高聚合度的寡糖生成，聚合度穩(wěn)定在4～11之間。對所生成的寡糖進(jìn)行ESI-MS/MS和1H-NMR分析，可證明產(chǎn)物為β-1,3-葡寡糖，且經(jīng)過對耦合催化條件的優(yōu)化，得出在100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)、100 mmol/L的蔗糖、50 mmol/L的葡萄糖、5 mmol/L的MgCl2、0.1 U/mL昆布二糖磷酸化酶、0.2 U/mL蔗糖磷酸化酶、40 ℃條件下反應(yīng)4 h，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)39.4%。以往的酶法合成需要昂貴的UDPG作為前體物質(zhì)，而傳統(tǒng)的化學(xué)法合成寡糖時(shí)，不僅需要加有保護(hù)基團(tuán)的昂貴前體物質(zhì)，并且由于需要多步迭代合成反應(yīng)，造成目的寡糖的得率極低。本文的方法摒棄了兩者的缺陷，僅需要價(jià)格低廉的葡萄糖和蔗糖為底物即可以實(shí)現(xiàn)β-1,3-葡萄糖的廉價(jià)合成，因而具有極大的產(chǎn)業(yè)化和市場化潛力。

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