李志軍　范凱　宋穎

[摘要] 目的 通過調(diào)查總結(jié)輸入性登革熱的防治經(jīng)驗，并建立Taqman MGB實時熒光PCR技術(shù)快速檢測登革熱病毒，更好地指導(dǎo)今后登革熱防制工作。 方法 流行病學(xué)調(diào)查，利用Taqman MGB技術(shù)，根據(jù)登革病毒3端非編碼區(qū)一段序列，設(shè)計登革1～4型熒光PCR通用引物和探針，以DF病毒株作為標(biāo)準(zhǔn)，以乙腦毒株作陰性對照，建立熒光PCR檢測DF的快速方法。同時給予1份ELISA法檢測陽性的臨床血清標(biāo)本進行熒光PCR擴增。 結(jié)果 采用PCR引物對登革1～4型病毒進行擴增，與設(shè)計相符；而乙型腦炎病毒均無非特異性擴增條帶，對引物的相關(guān)性實驗結(jié)果表明引物之間不會因相互干擾而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，1份疑似患者血標(biāo)本RT-PCR擴增陽性率為83.3%（25/30），其核酸序列與登革1型病毒柬埔寨株以及中國1997、1999年流行株GD14/97、GD05/99同源性分別為97%。 結(jié)論 在今后的登革熱防控工作中，我們應(yīng)用RT-PCR檢測方法時間短、靈敏性高、有較高的特異性，以此作為為DF的臨床早期診斷方法；其次重點加強出國和歸國人員的管理，開展登革熱防治知識的宣傳教育，建立和其他部門的登革熱聯(lián)防體制，加強基層醫(yī)務(wù)人員登革熱防治知識培訓(xùn)，提高基層醫(yī)務(wù)人員登革熱診治水平，來達到控制登革熱的目標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 輸入性；登革熱；監(jiān)測；RT-PCR

[中圖分類號] R512.8 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）09-0079-05

Survey， rapid detection method， prevention and control of first imported dengue fever of Jinzhou City in Liaoning Province

LI Zhijun1 FAN Kai2 SONG Ying2 LUO Mei3

1.Linghai Disease Control and Prevention Center in Liaoning Province， Linghai 121200， China； 2.Jinzhou Disease Control and Prevention Center in Liaoning Province， Jinzhou 121000， China； 3.Institute of Life Sciences， Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China

[Abstract] Objective To summarize the experience of prevention and treatment of imported dengue fever by investigation and to establish Taqman MGB real-time fluorescence PCR to detect dengue virus rapidly so as to better guide dengue fever prevention and control work in the future. Methods The epidemiological investigation was carried out in the field. According to a highly conserved sequence of the non-coding region of dengue virus 3 'end， dengue 1.4 fluorescent PCR universal primer and Taqman MGB probe were designed， using Taqman MGB technique. The rapid detection method of real-time fluorescence PCR detection of dengue virus was established， with Dengue fever virus strain as the standard and JE as the control. The clinical serum sample of the one case of ELISA test positive were amplified by RT-PCR and fluorescent PCR amplification. Results The dengue virus type 1 to 4 were amplified using PCR primers， which was consistent with the design. However， there was no non-specific amplification band for Japanese encephalitis virus. The primer correlation experimental results showed that the false positive results would not occur due to mutual interference between the primers. The positive rate of RT-PCR amplification in one suspected patient's blood sample was 83.3% （25/30）. Its nucleotide sequence homology with dengue virus type 1 Cambodia， China GD14/97， GD05/99 in 1997 and 1999 was 97%. Conclusion In the prevention and control of dengue fever in the future， RT-PCR is a rapid， sensitive and specific method， which can be used as an early clinical diagnostic method for dengue fever. Second， we will focus on strengthening the management of overseas personnel and returnees， develop the publicity and education of dengue fever prevention and treatment. We also establish the defense system of dengue fever with other departments， strengthen the training on dengue fever prevention and control among grassroots medical workers and improve the level of diagnosis and treatment of dengue fever among grassroots medical workers so as to achieve the goal of controlling dengue fever.

[Key words] Input；Dengue fever；Monitoring；RT-PCR

登革熱和登革出血熱是一種急性傳染病，是熱帶、亞熱帶地區(qū)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，由登革熱病毒經(jīng)蚊媒傳播[1]。據(jù)有關(guān)權(quán)威部門的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有7千萬到1億人感染DF病毒，每年24 000人死亡[2]。錦州市屬于登革熱非流行區(qū)從20世紀(jì)50年代初有疫情記載以來，無登革熱病本地感染病例。錦州市疾控中心于2015年2月15日對一例輸入性登革熱病例進行調(diào)查處理，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 個案調(diào)查

根據(jù)《登革熱流行病學(xué)個案調(diào)查表》進行病例調(diào)查，查看病例資料。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》（WS 216-2008）[3]。

1.2 實驗室檢查及病原學(xué)檢查

檢測血、尿和糞便常規(guī)及血清生化項目等；由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科采用熒光PCR法對采集的病例急性期血清標(biāo)本進行病原學(xué)檢測。

1.2.1 材料 乙腦病毒疫苗株由上海生物制品所提供。陽性血清標(biāo)本采自于錦州市近期發(fā)病1周內(nèi)的登革熱患者和發(fā)病10 d內(nèi)的乙型腦炎患者，-86℃保存。所有陽性臨床血清標(biāo)本根據(jù)實驗室IgM、IgG檢測為陽性進行確診。DV1～4型基因組RNA由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 Marker、DNA 連接酶、DNA質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pMD18-T載體等購于大連TaKaRa公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 RNA提取 1～4型DF病毒標(biāo)準(zhǔn)株采用1640培養(yǎng)基進行溶解，接種C6/36細胞，20℃～33℃進行培養(yǎng)、傳代，按病毒提取RNA試劑盒說明書進行提取，同時-86℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄與 PCR擴增 RNA反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)總體積為40 μL，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：10×緩沖液 10 μL，510 mmol/L 8×dNTP 2 μL，0.3 U/μL Random（金斯瑞公司生產(chǎn)）引物1 μL，RNA 12 μL，AMV Reverse Transcriptase（10 μL）1 μL混勻。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。產(chǎn)物放置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增：反應(yīng)總體積為20 μL，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture（10 mM） 1 μL，通用引物D1、D2（5 μmol/L）各1 μL，cDNA 0.5 μL（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型）、2 μL（Ⅲ型、血清標(biāo)本、陰性對照），ExTaq酶（5 U/μL）0.25 μL加H2O補足體系。

1.2.4 實時熒光PCR 需反應(yīng)的總體積為40 μL，在管內(nèi)依次加入：20×緩沖液4 μL，10 mmol/L MgCl2 2.5 μL，引物DenFP、DF-RP（10 μmol/L）各0.5 μL（Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅳ型），2 μL（Ⅲ型，血清標(biāo)本，陰性對照）Taq酶（5 U/μL）0.25 μL加H2O補足體系。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，進行40個循環(huán)，4℃保存。采用MX4000實時熒光PCR擴增儀進行擴增，Tm值由擴增片段的長度決定，延伸階段檢測熒光。

1.2.5 疑似DF患者血清標(biāo)本PCR擴增 選擇錦州凌海市疾控中心1例疑似DF患者發(fā)病早期的血清標(biāo)本進行多重PCR擴增。

1.2.6 基因克隆、鑒定和測序 擴增陽性PCR產(chǎn)物按照上海金斯瑞生物技術(shù)有限公司的DNA凝膠回收試劑盒說明書進行實驗，回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化JM109宿主菌，將搖好的菌液經(jīng)DNA質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行質(zhì)粒提取，PCR及酶切鑒定后，送至大連寶生物公司測序。

1.3 PCR檢測的特異性試驗

以DV1～4型病毒為陽性對照，不加DNA模板組、流行性乙型腦炎病毒均為陰性對照，應(yīng)用同樣方法進行擴增，驗證多重PCR的特異性。

1.3.1 PCR檢測敏感試驗 取DV1～4型細胞培養(yǎng)液進行1∶10稀釋，稀釋后分別取300 μL進行核酸提取，按上述方法進行RT-PCR，取5 μL RT-PCR產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。驗證RT-PCR的敏感性，同時DV1～4型特異性引物進行單引物擴增，以對比單引物和多引物敏感性的差異，見圖1。

M 1 2 3 4 5 6

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：陰性對照；2流行性乙型腦炎病毒；3：DV 4 型；4：DV 3 型；5：DV 2 型；6：DV 1 型

1.3.2 PCR檢測DV的敏感性 靈敏度：以DEN-1（圖2A）為例，1×103 copies/mL濃度核酸可見擴增曲線，1×102 copies/mL未見明顯擴增曲線，故 DEN-1檢測限為1×103 copies/mL，DEN-2 為1×102 copies/mL（圖2B），DEN-3為1×102 copies/mL（圖2C），DEN-4為1×102 copies/mL（圖2D）。

1.3.3 臨床疑似DF患者批標(biāo)本檢測結(jié)果 RT-PCR擴增1份早期患者血標(biāo)本，陽性率為83.3%（圖3）。2株陽性率為83.3%。2株陽性標(biāo)本經(jīng)克隆測序后，與DV1型柬埔寨株以及我國1997、1999年DV1型流行株同源性分別為97%、97%、98%，進一步證實為DV1（圖3）。

2 結(jié)果

2.1流行病學(xué)史

患者安某，納米比亞籍，女，27歲，遼寧錦州某大學(xué)本科留學(xué)生。自述2015年1月17日去馬來西亞旅游，2月12日經(jīng)廣州白云機場轉(zhuǎn)機回遼寧錦州，在廣州機場經(jīng)入境檢驗，確診登革熱病毒核酸陽性，但患者拒絕在廣州治療，于當(dāng)晚16時返回錦州學(xué)校。

2.2 臨床癥狀和診療情況

該患者于2月15日13時由同學(xué)陪同來錦州市疾控中心，詢問是否有登革熱治療的特效藥物。詢問得知其在12日發(fā)熱，最高體溫38.9℃，伴頭痛、肌肉痛，無其他癥狀。患病期間自行服退熱藥物，13日晚上19點到某醫(yī)學(xué)院附屬第一院就診，接診醫(yī)生初步問診驗血后，送檢檢驗科應(yīng)用Taqman MGB實時熒光PCR檢測，診斷登革熱臨床病例但沒有及時上報。

2.3實驗室檢查臨床檢驗結(jié)果

血白細胞計數(shù)2.49×109/L，中性粒細胞百分數(shù)75.5%，血小板計數(shù)76×109/L，異性淋巴細胞（-）；尿潛血（-），尿蛋白質(zhì)（-），尿白細胞（-），白蛋白28 g/L。

2.4 調(diào)查處置情況

病例在馬來西亞旅游期間有蚊蟲叮咬史，否認4周內(nèi)有傳染病患者接觸史，否認兩周內(nèi)有家禽鳥類密切接觸史，自述在廣州機場經(jīng)出入境部門確診登革熱，但無任何書面資料。2月15日采集患者血液標(biāo)本，于2月16日上送省疾控中心進一步檢驗，在等待結(jié)果期間，我中心2月17日上午10時接到市衛(wèi)計委轉(zhuǎn)發(fā)的廣東出入境檢驗檢疫局《關(guān)于從2月12日入境人員中檢出一例輸入性登革熱病例的情況通報》，市疾控中心17日11時通過中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)對該病例進行網(wǎng)絡(luò)直報，并同時將該情況上報省疾控中心。18日遼寧省疾控中心檢測結(jié)果為急性期血清登革熱病毒核酸陽性。

2.5診斷依據(jù)根據(jù)《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》（WS216-2008）[3]

該病例有明確流行病學(xué)史，結(jié)合臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及病原學(xué)檢測結(jié)果，確診為輸入性登革熱實驗室病例。

2.6 防治措施和效果評價

疾控中心建議病例到市傳染病醫(yī)院進行診治，但患者因身體已無不適表現(xiàn)，拒絕入院治療，疾控人員對該患者進行登革熱防治知識的健康宣教，告知登革熱無特效藥物，對癥治療為主，叮囑其控制體溫，多喝水、休息，如病情變化到醫(yī)院作進一步治療。建立聯(lián)防機制，明確學(xué)校責(zé)任人和聯(lián)系方式，指導(dǎo)該所大學(xué)開展登革熱防制工作，經(jīng)15 d醫(yī)學(xué)觀察，該患者的密切接觸人員無二代病例發(fā)生，患者痊愈。二月份我地區(qū)處于冬季，外環(huán)境無蚊蟲活動，故沒有開展蚊媒監(jiān)測和消殺工作。

3 討論

登革熱的臨床診斷經(jīng)歷了多種方法，目前逆轉(zhuǎn)錄式PCR 方法已經(jīng)應(yīng)用DF與黃病毒屬的其他成員的鑒別以及DF的類型鑒別[4-5]。除了在病毒基因組中選擇的特異性區(qū)域位置以及產(chǎn)物大小有所不同外，逆轉(zhuǎn)錄一套式PCR鑒定登革熱病毒的型別所采用的原理基本一致，這方面已多有報道[6-10]使用一對通用引物，擴增DV1～4型病毒的3末端非編碼區(qū)的核酸序列結(jié)果表明，該引物可以將登革病毒和同屬于黃病毒科的其他病毒區(qū)分，如日本腦炎病毒、黃熱病病毒等[11-13]。

我國東北地區(qū)以往發(fā)生登革熱病例情況很少見。根據(jù)本例輸入性登革熱病例的調(diào)查和處理，提示我們在今后的登革熱防制工作中重點做好如下工作[14]：

首先，要加強對去登革熱高發(fā)地區(qū)出國人員的管理，加強登革熱防治知識的宣傳教育，提高自我保護意識，歸國后應(yīng)先到到疾病控制部門建立健康檔案，一旦出現(xiàn)相關(guān)癥狀要及時到醫(yī)院就診，以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，防止輸入性DF的擴散[15-16]。近幾年來隨著對外經(jīng)貿(mào)關(guān)系的發(fā)展，錦州市赴東南亞等國家和地區(qū)務(wù)工、旅游、學(xué)習(xí)的人員越來越多，登革熱輸入病例風(fēng)險有增加趨勢。我國登革熱的防控現(xiàn)階段主要是依靠防止傳染源的傳入、控制蚊媒的辦法來預(yù)防和控制登革熱的傳播[17]。

其次，該病例疾控中心能及時開展流行病調(diào)查，查清相關(guān)信息，規(guī)范處理控制疫情，無二代病例出現(xiàn)得益于疫情聯(lián)防聯(lián)控機制充分有效的落實。該病例首診醫(yī)生未能規(guī)范上報疫情[18]，提示在今后輸入性傳染病防控方面，加強基層醫(yī)務(wù)工作者對DF知識培訓(xùn)，提高DF疫情報告意識；有關(guān)部門對衛(wèi)生檢疫、商務(wù)、外事有關(guān)部門的聯(lián)系，及時掌握外派人員特別是到疫情高發(fā)地區(qū)人員的相關(guān)信息，回國后健康狀況出現(xiàn)變化時疾控部門能及時調(diào)查和處理[19-20]。

最后，錦州歷史蚊媒監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示無伊蚊媒介，該輸入病例提示我們在今后的監(jiān)測工作中要關(guān)注登革熱傳播媒介伊蚊的監(jiān)測，落實防蚊滅蚊措施，即可阻斷登革熱傳播，杜絕二代病例的發(fā)生[5]。

[參考文獻]

[1] 黃誠孝，徐校平，王國祥，等.1例輸入性登革熱調(diào)查報告[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004，16（7）：33-39.

[2] Gibbons RV，Vasughn DW. Dengue：An escalating problem[J]. BMJ，2002，324（7353）： 1563-1566.

[3] 衛(wèi)生部. WS 216-2008登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：1-2.

[4] 方美玉，林立輝.登革病毒的研究進展[J].中華傳染病雜志，2000，18（2）：138-141.

[5] 王敬軍，王麗，鄧勇，等.陜西省調(diào)查處理輸入性登革熱病例的報告[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7（9）：1633-1645.

[6] Deubel V，Laille M，Hugnot JP，et al. Identification of dengue sequences by genomic amplification：Rapid diagnosis of dengue virus serotypes in peripheral blood[J].Journal of Virological Methods，1990，30（1）：41-54.

[7] Ruiz BH，Zamora MP，Liu S. Detection of dengue viral RNA by microplate hybridization[J].Journal of Virological Methods，1995，54（2-3）：97-108.

[8] Barlow，D.H.Unraveling the mysteries of anxiety and its disorders from the perspective of emotion theory[J]. Am Psychol，2000，55（11）：1247-1263.

[9] Lucia HL，Kangwanpong D.Identification of dengue virus-infected cells in paraffin-embedded tissue using in situ polymerase chain reaction and DNA hybridization[J].Journal of Virological Methods，1994，48（1）：1-8.

[10] Henchal EA，Polo SL，Vorndam V，et al. Sensitivity and specificity of a universal primer set for the rapid diagnosis of dengue virus infections by polymerase chain reaction and nucleic acid hybridization[J].American Journal of Tropical Medicine and Hygiene，1991，45（4）：418-428.

[11] Jelinek T. Dengue fever in international travelers[J]. Clinical Infectious Diseases，2000，31（1）：144-147.

[12] Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever[J]. Clin Microbiol Rev，1998，11（3）：480-496.

[13] Kautner I，Robison MJ，Kubnle U. Dengue virus infection：Epidemiology pathogenosis clinical presentation diagnosis and prevention[J].Journal of Pediatrics 1997，5（8）：131.

[14] 趙志國.中國登革熱病控制概述[J].中國流行病學(xué)雜志，2000，6（2）：223-224.

[15] 于曼，韓劍峰，陳水平. 2006年廣州登革熱病病原體分離鑒定及生物學(xué)性質(zhì)觀察[J].生物技術(shù)通訊，2008，19（6）：56.

[16] 張海林，付士紅，鄧掌，等. 登革病毒的基因結(jié)構(gòu)及其基因檢測[J].中華流行病學(xué)雜志，2013，34（5）：77-78.

[17] 王靜林，張海林，孫肖紅. 登革病毒實時熒光PCR快速檢測技術(shù)研究[J].中國人獸共患病學(xué)雜志，2008，24（7）：84.

[18] 任瑞文，方美玉，劉建偉，等. 多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)快速檢測登革病毒及其臨床應(yīng)用[J].中華流行病學(xué)雜志，2005，1（26）：82.

[19] 韓萬柏，楊學(xué)穎. 我國登革熱研究概述[J].臨床醫(yī)學(xué)雜志，2003，31（3）：21.

[20] 肖維威，馬文麗，鄭文嶺. 云南登革4型病毒的鑒定及NS1，NS2a基因序列分析[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003， 26（3）：42.

（收稿日期：2017-12-09）