任明亮，李輝，劉冬斌，陳國雄，譚鎮(zhèn)南，劉鵠(南方醫(yī)科大學附屬南海醫(yī)院，廣東佛山528200)

骨肉瘤是一種多發(fā)于青少年的原發(fā)惡性骨腫瘤，易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[1～3]。近年來骨肉瘤的治療已進入瓶頸期，患者5年生存率一直沒有得到明顯提高。微小核糖核酸(miRNA)是由20～25個核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，通過結(jié)合靶基因的3′UTR區(qū)而抑制其表達，參與細胞分化、增殖、程序性死亡等多種重要生理過程[4]。miR-196a是近期發(fā)現(xiàn)的miRNA家族重要成員之一，其在喉癌[5]、結(jié)腸癌[6]、食管癌[7]等多種惡性腫瘤中表達失調(diào)。但目前miR-196a在骨肉瘤細胞中的表達變化及其對骨肉瘤細胞惡性生物學行為影響的研究較少。為此，我們于2016年12月～2017年7月進行了如下研究，以期為骨肉瘤的發(fā)病機制和靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級BALB/c雄性裸鼠12只，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購自北京維通利華動物實驗中心。細胞：人骨肉瘤細胞系MG-63及人成骨細胞hFOB1.19均購自美國ATCC公司。主要試劑：TRIzol Reagent、LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司；miR-196a inhibitor、陰性對照inhibitor-NC、miR-196a特異性引物和內(nèi)參U6均由廣州銳博生物有限公司設(shè)計合成；叉頭框蛋白1(FOXO1)、GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成；CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Anexin-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司；一抗FOXO1和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 骨肉瘤細胞及成骨細胞miR-196a表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。MG-63細胞及hFOB1.19細胞均采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的MG-63細胞及hFOB1.19細胞，按照說明書用TRIzol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性。將總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書，應(yīng)用PCR儀進行定量檢測。引物序列：miR-196a 正向引物：5′-GCTCTGGCTCCGTGTCTTCACTCCC -3′，反向引物：5′-TGCCCCAGCACAGCCCCCGTCCCTC-3′；內(nèi)參U6 正向引物：5′-CATTGGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物：5′-CAGGCTTGAATTTGCGTGTCATCC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s， 60 ℃退火34 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算 miR-196a相對表達量。結(jié)果顯示，MG-63細胞及hFOB1.19細胞miR-196a相對表達量分別為8.70±0.42、1.01±0.05，二者比較P<0.05。

1.3 miR-196a對MG-63細胞增殖、凋亡及成瘤能力影響的觀察

1.3.1 細胞分組處理 取對數(shù)生長期MG-63細胞，隨機分為miR-196a inhibitor組和inhibitor-NC組，采用LipofectamineTM2000按照說明書操作分別轉(zhuǎn)染miR-196a inhibitor和inhibitor-NC。轉(zhuǎn)染24 h檢測以下指標。

1.3.2 miR-196a表達 參照1.2的方法檢測兩組miR-196a相對表達量。

1.3.3 細胞增殖能力 采用CCK-8法。將兩組轉(zhuǎn)染后的細胞按1×104/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h每孔加入10 μL CCK-8液，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。終止孵育后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔450 nm波長處的光密度(OD)值，以O(shè)D450表示細胞增殖能力。每孔設(shè)置4個復孔及空白對照孔。

1.3.4 細胞凋亡能力 采用流式細胞術(shù)。轉(zhuǎn)染48 h取兩組細胞，胰酶消化后，PBS沖洗兩遍。收集細胞至離心管中，4 ℃條件下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS沖洗兩遍，加入結(jié)合緩沖液，制成密度為1×106/mL的細胞懸液。每組取細胞懸液5 mL于流式管中，依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，混勻后室溫下避光染色15 min。上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5 細胞成瘤能力 采用裸鼠皮下成瘤實驗。轉(zhuǎn)染24 h取兩組細胞，參照1.3.4的方法制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×108/mL。取12只裸鼠隨機分為miR-196a inhibitor組和inhibitor-NC組，每組6只，分別于右側(cè)后腿皮下注射0.1 mL miR-196a inhibitor和inhibitor-NC細胞懸液。每日觀察皮下腫瘤生長情況，每5天測量移植瘤體積(V)，共測量4次。V(mm3)=1/2×L×W2，L為腫瘤長度，W為腫瘤寬度。20天后處死所有裸鼠，取移植瘤，稱取移植瘤質(zhì)量。

1.4 miR-196a對MG-63細胞FOXO1 mRNA及蛋白表達影響的觀察

1.4.1 FOXO1 mRNA表達 取1.3.1中轉(zhuǎn)染24 h的兩組細胞，參照1.2的方法檢測細胞FOXO1 mRNA相對表達量。FOXO1 正向引物： 5′-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3′，反向引物：5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′，GAPDH 正向引物：5′-GGTGATGCTGGTGCTGAGTA-3′，反向引物：5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算FOXO1 mRNA相對表達量。

1.4.2 FOXO1蛋白表達 采用Western blotting法。取1.3.1中轉(zhuǎn)染24 h的兩組細胞，PBS漂洗3次，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品上樣，行10% SDS-PAGE，分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5% 脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h。分別加入FOXO1(1∶500)一抗和GAPDH一抗 (1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h。加入ECL顯影液顯影后凝膠成像儀曝光拍照，應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，以FOXO1與GAPDH條帶灰度值的比值計算FOXO1蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-196a表達比較 miR-196a inhibitor組、inhibitor-NC組miR-196a相對表達量分別為0.31±0.08、1.03±0.03，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組細胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組細胞增殖能力比較

注：與inhibitor-NC組同時間點比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 兩組細胞凋亡能力比較 miR-196a inhibitor組、inhibitor-NC組細胞凋亡率分別為(23.50±2.11)%、(3.44±0.39)%，兩組比較P<0.01。

2.4 兩組成瘤能力比較 miR-196a inhibitor組各時間點移植瘤體積均小于inhibitor-NC組(P均<0.01)，見表2。miR-196a inhibitor組、inhibitor-NC組移植瘤質(zhì)量分別為(0.50±0.09)、(1.20±0.14)g，兩組比較P<0.01。

表2 兩組移植瘤體積比較

注：與inhibitor-NC組同時間點比較，#P<0.01。

2.5 兩組FOXO1 mRNA和蛋白表達比較 miR-196a inhibitor組、inhibitor-NC組FOXO1 mRNA相對表達量分別為6.14±0.36、1.05±0.06，F(xiàn)OXO1蛋白相對表達量分別為0.53±0.14、0.12±0.06；兩組比較P均<0.05。

3 討論

目前普遍認為，細胞無限增殖和凋亡受阻導致的增殖-凋亡失衡是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機制[8]。基因治療已成為骨肉瘤治療研究中的熱點，腫瘤基因靶向治療的基礎(chǔ)就是抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡。He等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-34可以通過p53依賴途徑抑制CDK4/6、cyclin E2、E2F3/5、cMET、bcl-2表達，誘導細胞周期G1期阻滯，共同調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的增殖和凋亡。Zhao等[10]報道，下調(diào)骨肉瘤細胞中miR-34表達能夠通過上調(diào)PTEN基因表達，從而抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡。Thayanithy等[11]證實，miR-382、miR-134、miR-369-3p、miR-544等14q32位點的miRNA在骨肉瘤中表達降低，上調(diào)這些miRNA表達可以促進骨肉瘤細胞凋亡。

miR-196a是近期發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員之一，從HOX家族基因轉(zhuǎn)錄而來。Sun等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-196a在胃癌組織和細胞系中表達明顯升高，并且miR-196a表達與患者的腫瘤大小、臨床分期密切相關(guān)，miR-196a高表達者預后較差。Liu等[13]報道，miR-196a在非小細胞肺癌組織和細胞系中異常高表達，miR-196a通過下調(diào)HOXA5基因表達而促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移。但目前有關(guān)miR-196a在骨肉瘤中的表達情況及作用機制尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，MG-63細胞中miR-196a相對表達量明顯高于hFOB1.19細胞，提示miR-196a在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能具有癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miR-196a表達的MG-63細胞增殖能力明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，說明抑制miR-196a表達能夠抑制骨肉瘤的進展。裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示，降低MG-63細胞中miR-196a表達能夠明顯降低裸鼠移植瘤的生長速度。

miRNA的作用主要取決于其調(diào)控的下游靶基因的生物學效應(yīng)。FOXO1是FOXO家族的重要成員之一，參與細胞增殖、凋亡和分化等眾多重要細胞功能的調(diào)控。FOXO1可通過對下游多種靶基因進行表達調(diào)控，包括抑制細胞生長、調(diào)控細胞周期、促進細胞凋亡、抗過氧化損傷等多重作用，作為腫瘤抑制因子參與到多種腫瘤的形成過程。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中miR-196a通過靶向調(diào)控FOXO1基因的表達調(diào)控細胞增殖、凋亡和侵襲。Hou等[15]報道，miR-196a能夠通過調(diào)控FOXO1基因促進宮頸癌細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)MG-63細胞中miR-196a表達后細胞FOXO1 mRNA和蛋白表達均明顯升高，提示miR-196a在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用可能是通過負向調(diào)控FOXO1基因?qū)崿F(xiàn)的。

綜上所述，miR-196a在骨肉瘤細胞中表達升高，下調(diào)miR-196a表達能夠明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖及成瘤能力，并促進其凋亡，其機制可能與靶向調(diào)控FOXO1基因表達有關(guān)。FOXO1有可能成為骨肉瘤基因治療的潛在靶點。

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