周曉舟，陳士國，葉興乾

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

原花色素具有多酚類物質普遍具有的抗氧化性等活性[1-8]，在保健品與化妝品領域的應用已較為普遍[9-14]，而在治療疾病方面，對心血管疾病[15-16]、糖尿病[17]、癌癥[18-19]、肥胖[20-21]、精神疾病[22-23]等也有不少相關報道。Yang Haihua等[24]的研究表明楊梅的樹葉含有豐富的原花色素，其類型基本為原飛燕草素，而原飛燕草素因為其棓酸酯化結構而具有更強大的抗氧化等生物活性[25]。在本課題組之前的研究中[26]，通過大孔樹脂對楊梅葉原飛燕草素進行了有效提純，得到了原飛燕草素質量分數為53%的楊梅葉提取物，隨后利用此提取物進行了對肥胖治療的初步研究。其中，衡量肥胖治療效果的一個經常采用的標準，也是檢驗某類物質能否抑制人體從外界攝入脂肪的檢測對象，就是胰脂肪酶或者磷脂酶的活性[27]。

脂肪酶全稱為甘油三酯基水解酶，是一種特殊的酯基水解酶。其中主要來自于胰腺的胰脂肪酶是胰腺分泌的多種消化酶之一，也是人體從外界攝入脂肪的必要消化酶之一，可水解50%～70%的膳食脂肪。脂肪酶的作用是將外界攝入的脂肪進行分解，分解得到的甘油和脂肪酸被人體小腸吸收后，在肝臟重新合成能夠被人體利用的脂肪[28]。

磷脂酶是磷脂酶A1、A2、B、C、D等亞型的統(tǒng)稱，是能夠水解體內以及外界攝入磷脂的一類脂質水解酶，在動植物體內廣泛存在，其中磷脂酶A1主要存在于細胞溶酶體內，能夠催化甘油磷脂的第一位酯鍵斷裂，產生脂肪酸，是催化分解產生脂肪酸的重要途徑之一。磷脂是生物膜的重要組成部分，人類通過食物的攝入從外界攝取的磷脂是人體內磷脂組成的重要來源，同時通過磷脂酶的水解作用得到的甘油和脂肪酸也是人體重新合成脂肪的重要來源[29]。我們所食用的食物，除了甘油三酯，還存在大量的各種生物膜，因此人體攝入的脂肪總量非常大。

人體通過食物攝入的脂肪，在胰脂肪酶和磷脂酶A1的作用下，分解成大量的能夠被利用的甘油和脂肪酸。而一旦抑制了脂肪酶或者磷脂酶A1的活性，就能夠抑制人體對食物中的脂肪以及磷脂的分解，從而使得人體攝入的脂肪減少，達到抑制肥胖的目的[30]。

本實驗采用奧利司他（Orlistat）以及文獻[26]中提到的楊梅葉粉末（leaf powder of Chinese bayberry，LCB）、楊梅葉含糖提取物（non-desugarized prodelphinidins extract，NDPE）和楊梅葉去糖提取物（desugarized prodelphinidins extract，DPE）作為研究對象，構建了肥胖大鼠模型，針對胰脂肪酶和磷脂酶A1進行了體內外活性抑制能力的比較，并對抑制能力較好的提取物進行了進一步的分析，包括測定其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和抑制類別，為評價其作為減肥產品的潛力和進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Orlistat標準品 阿拉丁試劑有限公司；LCB、NDPE、DPE其原飛燕草素質量分數經測定分別為4.3%、26.0%、53.0%。

大豆?jié)饪s磷脂、4-甲基傘形酮油酸酯（4-methylumbelliferyl oleate，4-MUO）標準品和三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）阿拉丁試劑有限公司；豬胰腺脂肪酶、人磷脂酶A1上海勁馬生物科技有限公司；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、乙醇和鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

熒光酶標儀 美國Thermo Fisher公司；916Ti-Touch自動滴定儀 瑞士萬通公司；KDS-12電熱恒溫水浴鍋嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；TD5K臺式低速離心機長沙東旺實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

1.3.1.1 飼料配制

表1 實驗動物飼料成分表Table 1 Feed ingredients of experimental animals g/kg

大鼠飼料自行配制，具體成分如表1所示，其中礦物質混合物及維生素復合物均參照AIN-93配方。高脂飼料由79%（質量分數，下同）普通飼料，20%豬油和1%膽固醇組成。普通飼料與高脂飼料在經過輻照處理后，壓模成短棍狀便于飼喂。

1.3.1.2 大鼠造模

選用雄性SD大鼠，按體質量隨機分為6 組：NF組、HF組、Orlistat組、LCB組、NDPE組和DPE組，每組8 只，共48 只?？紤]到造膜成功性，需大鼠60 只。將60 只實驗大鼠放入鋼絲籠內飼喂，每籠4 只，自由攝食和飲水，每周記錄食量，連續(xù)喂養(yǎng)4 周。正常組按普通飼料喂食，模型組和治療組都按HF飼料喂食，室溫（23±2）℃，12 h明暗交替，4 周后測定體質量，造模成功的標準為超過同時飼喂的正常大鼠體質量的10%。

1.3.1.3 干預實驗

篩選造模成功的大鼠，分別安排不同飼料繼續(xù)飼喂。正常組仍為NF組飼料，模型組為HF組飼料，干預組分別為Orlistat組、LCB組、NDPE組、DPE組飼料。室溫（23±2）℃，12 h明暗交替，每隔一周稱取一次體質量，經約4 周喂食，結束實驗。

1.3.2 酶活力的測定

胰脂肪酶活力測定參考文獻[10]，有所改動。分別取1 mg的Orlistat、LCB、NDPE以及DPE溶解到10 mL緩沖溶液中，作為抑制劑參與抑制胰脂肪酶分解脂質的反應。相同環(huán)境下，在96 孔板中按順序添加25 μL抑制劑、10 μL底物4-MUO、40 μL Tris-HCl緩沖液、25 μL胰脂肪酶開始反應，所有反應物均使用Tris-HCl緩沖液配制成一定質量濃度的溶液?？瞻讓φ沼?5 μL的Tris-HCl緩沖液替代抑制劑，在25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)一定時間后，添加100 μL pH 4.2的檸檬酸緩沖液用以使反應停止。體內酶活力測定時，大鼠經過頸部脫臼處死，立即解剖后截取相同質量的大鼠小腸段，溶于相應的緩沖溶液中，然后進行熒光強度的測定。

胰脂肪酶活力以由熒光強度計算出的抑制率作為參考標準，按公式（1）進行計算。

式中：Y0為空白對照的熒光強度；Ym為無抑制劑添加組的熒光強度；Yn為不同抑制劑添加組的熒光強度。

磷脂酶A1活力檢測參考文獻[10]，有所改動。將4 g的底物大豆?jié)饪s磷脂、0.5 g PVA溶于100 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，離心機1 000 r/min均質3 min，得到底物溶液。取4 個100 mL高型燒杯，2 個作為空白瓶，2 個作為樣品瓶，各加底物溶液25 mL，再于空白瓶中加入95%乙醇15 mL，水浴預熱5 min，然后在各瓶中加入磷脂酶A1液的稀釋液1 mL（用磷酸鹽緩沖液稀釋），立即混勻計時，在水浴中反應一定時間，于樣品瓶中立即補加95%乙醇15 mL終止反應，于自動滴定儀下用NaOH標準溶液滴定（按GB/T 601—2002《化學試劑 標準滴定溶液的制備》配制和標定，NaOH濃度為0.5 mol/L），計算標準堿液平均消耗量。

磷脂酶活力定義為：在特定條件下1 min水解磷脂產生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量即為一個磷脂酶活力單位（U）。對于液體酶制劑，其酶活力表示為每克酶液所測得的磷脂酶活力單位，即U/g。按公式（2）進行計算。

式中：V為滴定樣品時消耗的NaOH標準溶液體積/mL；V0為滴定空白時消耗的NaOH標準溶液體積/mL；c為NaOH標準溶液的濃度/（mol/L）；50為1.00 mL 0.05 mol/L NaOH標準溶液相當于脂肪酸50 μmoL；n為酶液樣品的稀釋倍數；t為測定酶活力時的反應時間/min。

為方便進行比較，磷脂酶的酶活力轉化為抑制劑對磷脂酶的抑制率來表示。按公式（3）進行計算。

式中：V為滴定樣品時消耗的NaOH標準溶液體積/mL；V0為滴定空白時消耗的NaOH標準溶液體積/mL。

1.3.3 抑制類型的判定

由于待測樣品的區(qū)別在于楊梅葉原花色素質量濃度的高低，為了更好說明楊梅葉原花色素與抑制胰脂肪酶和磷脂酶A1活性的構效關系，根據現(xiàn)有樣品中楊梅葉原花色素的質量濃度，選擇其中質量濃度較高的DPE組作為主要研究對象，測定其IC50并判定其抑制類型。

根據酶促反應的機制，需基于米氏常數（Km）和最大反應速率（vmax）的測定來鑒別抑制劑抑制類別。Km表示的是酶促反應速率達到vmax一半時的底物濃度，它能夠表示酶和底物的親和程度，是酶的特征常數之一。vmax表示的是酶完全被底物飽和時的反應速率。根據酶促反應動力學測定繪圖：在競爭性抑制的酶促反應過程中，當抑制強度增大時，直觀地表現(xiàn)為抑制劑濃度的增大，Km值變大，vmax值不變；在非競爭性抑制的酶促反應過程中，當抑制強度增大時，直觀地表現(xiàn)為抑制劑濃度的增大，Km值不變，vmax值減小。而抑制常數（Ki）被稱為酶-抑制劑復合物解離常數，是表現(xiàn)抑制劑與酶親和度的一個指標，Ki值越小代表抑制劑與酶的結合越穩(wěn)定，從而說明其抑制能力越強。

選取不同的DPE質量濃度（0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 mg/mL），分別在反應1底物濃度[S1]（1 mmol/L）和反應2底物濃度[S2]（2 mmol/L）條件下測定每分鐘反應消耗底物的量，即反應速率v，然后以DPE質量濃度為橫坐標，反應速率v的倒數1/v為縱坐標做散點圖，繪制Dixon圖，得到Ki值。

選取不同的底物質量濃度[S]（0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 mg/mL），分別在有DPE（質量濃度為0.012 4 mg/mL）或無DPE的情況下測定反應速率v。以[S]的倒數1/[S]為橫坐標，v的倒數1/v為縱坐標做散點圖，繪制Lineweaver-Burk圖，得到Km值，檢驗酶與抑制劑的結合穩(wěn)定性，并判定抑制類型。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 體質量變化

表2 不同抑制劑對大鼠體質量的影響（n＝8）Table 2 Effect of different inhibitors on body weight in SD rats (n= 8)g

圖1 抑制劑干預實驗后SD大鼠體質量變化情況Fig. 1 Body weight changes of SD rats after intervention with inhibitors

大鼠初始體質量在140～150 g，造模成功的大鼠體質量在325～356 g，高于普通飼料喂養(yǎng)的SD大鼠至少10%，具體變化見表2。不同組SD大鼠抑制劑干預實驗后體質量變化情況如圖1。其中在50 d時體質量下降是由解剖前一夜的空腹處理導致的。相對于高脂組，其他組體質量增長均較緩，但都呈現(xiàn)一個逐漸增長的態(tài)勢。從圖1中可以看出最終體質量由大到小分別為HF組、LCB組、NF組、DPE組、Orlistat組、NDPE組，但由于初始體質量的不同，體質量增長量的大小和最終體質量排序有差異。

2.2 脂肪酶活力變化

圖2 不同抑制劑對胰脂肪酶的抑制率Fig. 2 Inhibition percentage of different inhibitors against pancreatic lipase

如圖2所示，由熒光強度計算得到的抑制率顯示：空白對照的抑制率為1.5%，基本沒有抑制作用；Orlistat的抑制率最大，達到了99.0%，且與其他抑制劑的差異顯著；LCB與NDPE差異不顯著，分別為83.2%和86.1%，與DPE差異顯著；DPE的抑制率為90.9%，與NDPE之間差異不顯著。

圖3 不同抑制劑對SD大鼠小腸胰脂肪酶活性的抑制率Fig. 3 Inhibition percentage of different inhibitors against pancreatic lipase in the small intestine of SD rats

由圖3可知，不同干預組之間的差異顯著，且干預組與NF組、HF組間差異顯著。NF組和HF組的抑制率分別為0.6%和1.0%，基本沒有抑制作用，而Orlistat組的抑制率最大，達到了96.5%，其次是DPE組、NDPE組和LCB組，分別為91.4%、83.9%和71.8%。其結果和體外酶活力測定結果相似。

2.3 磷脂酶A1活力變化

圖4 不同抑制劑對磷脂酶A1的抑制率Fig. 4 Inhibition percentage of different inhibitors against phospholipase A1

由圖4所示，以消耗的NaOH標準溶液體積計算得到抑制率，不同干預組與空白對照之間差異顯著，空白對照的抑制率為2.7%，基本沒有抑制效果。Orlistat與LCB的差異顯著（分別為97.1%和90.9%），NDPE、DPE的差異不顯著（分別為94.5%和96.7%）。LCB與NDPE之間差異不顯著，與DPE差異性顯著。

圖5 不同抑制劑對SD大鼠小腸磷脂酶A1活性的抑制率Fig. 5 Inhibition percentage of different inhibitors against phospholipase A1 in the small intestine of SD rats

由圖5可知，不同干預組之間的差異顯著，且干預組與NF組、HF組間差異顯著。NF組和HF組的抑制率分別為8.6%和2.7%，基本沒有抑制作用，而Orlistat組的抑制率最大，達到了97.2%，其次是DPE組、NDPE組和LCB組，分別為87.7%、77.3%和64.4%。其結果和體外酶活力測定結果相似。

2.4 IC50變化

圖6 DPE溶液質量濃度對胰脂肪酶活性抑制的影響Fig. 6 Effect of DPE concentration on the activity of pancreatic lipase

設定底物濃度1 mmol/L，DPE溶液對酶促反應的抑制效果以抑制率來表示。由圖6可以看出，DPE溶液質量濃度從0 mg/mL到0.05 mg/mL增加時，抑制能力在逐漸增強，在質量濃度達到0.05 mg/mL以后，抑制能力達到最大進而保持不變，得到DPE溶液對胰脂肪酶的IC50為0.01 mg/mL。同樣的方法對DPE溶液對磷脂酶A1活性抑制的影響作用作圖，如圖7所示，可知其IC50為0.06 mg/mL。

圖7 DPE溶液質量濃度對磷脂酶A1活性抑制的影響Fig. 7 Effect of DPE concentration on the activity of phospholipase A1

2.5 抑制類型

圖8 DPE對胰脂肪酶反應Dixon圖Fig. 8 Dixon plot of the inhibition of DPE against pancreatic lipase

圖8顯示的是DPE對胰脂肪酶反應的Dixon圖，在[S1]為1 mmol/L和[S2]為2 mmol/L情況下所做的散點分別連線相交于第三象限的一點，該點的橫坐標為-0.028，即Ki值為0.028 mg/mL，表明DPE與酶的結合很穩(wěn)定，其抑制作用屬于競爭性抑制+反競爭性抑制的混合抑制類型。

圖9 DPE對磷脂酶A1反應Dixon圖Fig. 9 Dixon plot of the inhibition of DPE against phospholipase A1

圖9顯示的是DPE對磷脂酶A1反應的Dixon圖，在[S1]為1 mmol/L和[S2]為2 mmol/L情況下所做的散點分別連線相交于橫坐標左側一點，該點的橫坐標為-0.069，即Ki值為0.069 mg/mL，表明DPE與酶的結合很穩(wěn)定，其抑制類型屬于競爭性抑制。

圖10 DPE對胰脂肪酶反應Lineweaver-Burk圖Fig. 10 Lineweaver-Burk plot of pancreatic lipase inhibition by DPE

如圖10所示，無DPE散點圖連線與縱坐標的交點為6 812，有DPE散點圖連線與縱坐標的交點為3 572，說明其vmax分別為6 812 μmol/min和3 572 μmol/min，而有DPE散點圖連線交于橫坐標上-4.1，得到Km值為0.25 mg/mL。

圖11 DPE對磷脂酶A1反應的Lineweaver-Burk圖Fig. 11 Lineweaver-Burk plot of phospholipase A1 inhibition by DPE

如圖11所示，無DPE和有DPE散點圖連線交于縱坐標上同一點4 871，有DPE散點圖連線交于橫坐標上-11.1，得到Km值為0.09 mg/mL。

3 結 論

通過對LCB、NDPE、DPE以及Orlistat對胰脂肪酶和磷脂酶A1體外活性的影響做比較，得知DPE具有較好的抑制2 種酶活力的能力，其活性抑制能力稍低于Orlistat，在體外抑制磷脂酶A1的能力上甚至幾乎與Orlistat相同。通過對截取SD大鼠小腸進行的腸道酶活力檢驗發(fā)現(xiàn)，楊梅葉原飛燕草素抑制體內胰脂肪酶和磷脂酶A1活性的能力與體外實驗表現(xiàn)基本一致。測定了DPE對胰脂肪酶的IC50為0.01 mg/mL，其抑制類型根據Dixon圖判斷為競爭性抑制+反競爭性抑制的混合抑制類型，根據Lineweaver-Burk圖發(fā)現(xiàn)vmax與Km值均發(fā)生變化，DPE參與反應的Km值為0.25 mg/mL。測定了DPE對磷脂酶A1的IC50為0.06 mg/mL，其抑制類型根據Dixon圖判斷為競爭性抑制，根據Lineweaver-Burk圖發(fā)現(xiàn)vmax值不變，DPE參與反應的Km值為0.09 mg/mL。DPE分別通過抑制胰脂肪酶和磷脂酶A1的活性影響脂肪的代謝，抑制能力能夠與Orlistat媲美。

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