孫 慧，吳 華,2，張 振，韓 榆，俞慈英，杜希華

（1. 山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省逆境植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所，山東 青島 266101；3. 浙江省舟山市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 定海 316000）

土壤鹽漬化是全球性的生態(tài)問題。高鹽逆境會對植物造成離子和滲透脅迫，引發(fā)氧化脅迫和營養(yǎng)虧缺。鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧是造成細(xì)胞傷害的一個重要原因。在正常生理?xiàng)l件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。但在鹽漬、干旱等逆境條件下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，引發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，影響細(xì)胞膜的完整性及各種酶的活性，使植物受害甚至死亡[1]。研究證實(shí)，抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)（AsA-GSH cycle)系統(tǒng)是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要途徑[2]。該循環(huán)途徑中抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR)，以及抗氧化劑抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）能夠有效地清除植物體內(nèi)積累的活性氧，有助于提高植物的抗逆性。因此，可根據(jù)植物體內(nèi)APX，GR等酶的活性和AsA，GSH等非酶物質(zhì)含量的變化來衡量植物的抗逆性[3]。

海濱木槿Hibiscus hamabo為錦葵科Malvaceae木槿屬Hibiscus落葉灌木或小喬木，主要分布于我國浙江定海、鎮(zhèn)海、舟山島西部及長山寺等，為浙江省珍稀瀕危植物，具有耐鹽堿、耐旱抗?jié)场⒛屯寥镭汃さ葍?yōu)良特性，花色艷麗，根系發(fā)達(dá)，對土壤的適應(yīng)能力及抗風(fēng)能力較強(qiáng)[4]，既是沿海地區(qū)優(yōu)良的堤岸防護(hù)林樹種，也是寶貴的園林綠化樹種。目前，關(guān)于海濱木槿的研究主要集中于形態(tài)特征、馴化栽培等方面[5]，關(guān)于NaCl脅迫下海濱木槿生理響應(yīng)方面的研究尚不多見，更未見有關(guān)NaCl脅迫對海濱木槿AsA-GSH循環(huán)影響的研究報(bào)道[6]。本研究設(shè)置了不同NaCl濃度梯度，對NaCl脅迫下不同時期海濱木槿幼苗AsA-GSH循環(huán)中各個組分進(jìn)行了測定分析，分析了AsA-GSH循環(huán)參與調(diào)控海濱木槿耐鹽的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海濱木槿種子由浙江省舟山市農(nóng)林科學(xué)研究院提供，2013年11月采自舟山市定海區(qū)。以海濱木槿子葉期幼苗和早期幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

海濱木槿種子的預(yù)處理及萌發(fā)參照薄鵬飛等[7]的方法，于2014年6，7月分兩批進(jìn)行沙培。挑選飽滿種子播于盛有細(xì)砂的塑料盆中，每天用清水澆灌1次，種子萌發(fā)后改用1/2 Hoagland營養(yǎng)液（pH 6.0）澆灌。一批待種子萌發(fā)長出2片子葉、第一片真葉尚未展開（子葉期幼苗）；一批培養(yǎng)至具5～6片真葉（早期幼苗），進(jìn)行鹽處理。對照用1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌，鹽處理材料用含NaCl的1/2 Hoagland處理液澆灌，采用每12 h遞增50 mmol·L-1NaCl的方式處理至終濃度分別為150和300 mmol·L-1。達(dá)到終濃度后，每天早晚各澆灌1次處理液，澆灌量為細(xì)砂持水量的2倍，以保持鹽濃度的穩(wěn)定。處理7～9 d后，分別取子葉期幼苗的子葉和早期幼苗的第2至第4位葉片，測定相關(guān)生理指標(biāo)，每個處理重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

SOD（超氧化物歧化酶）活性的測定參照劉志禮等[8]的方法并稍作修改。取0.1 g葉片加入1.5 mL提取介質(zhì)，4℃，15 000 rpm 離心 15 min，反應(yīng)體系由 0.01 mL 酶液與 4mL 反應(yīng)介質(zhì) （50 mmol·L-1PBS，pH 7.0；1 mmol·L-1EDTA；130 mmol·L-1Met；77.12 μmol·L-1NBT；80.2 μmol·L-1核黃素）組成，在 72 μmol·m-2·s-1日光燈下反應(yīng)20 min，以不加酶液的體系為對照，測定560 nm處的吸光度值，以每分鐘內(nèi)NBT抑制光化還原50%為一個酶活單位（U）。

APX活性的測定按Nakano等[9]的方法。

GR活性的測定參照Foster等[10]的方法，稍加修改。酶提液同SOD，反應(yīng)體系為0.15 mL酶液加入2.6 mL反應(yīng)介質(zhì)（50 mmol·L-1PBS，pH 7.0；1 mmol·L-1EDTA；5 mmol·L-1MgCl2），加 0.2 mL 1 mmol·L-1的 NADPH和0.05 mL 10 mmol·L-1GSSG，以2.95 mL反應(yīng)介質(zhì)加0.05 mL GSSG的反應(yīng)體系作對照，混勻后立刻記下340 nm處的起始（0 min）吸光度值，以后每隔1 min記錄1次，連續(xù)測5 min。以每分鐘內(nèi)氧化1 μmol NADPH的酶量作為一個酶活單位（U）。

AsA含量的測定根據(jù)Tanaka等[11]的方法，并加以改進(jìn)。取0.1 g葉片加入1.5 mL提取介質(zhì)（5%（W/V）TCA；1 mmol·L-1EDTA）和少量石英砂在冰上研磨至勻漿，4℃，15 000 rpm離心15 min，上清液即為AsA待測液，取0.2 mL待測液+1.4 mL PBS（pH 7.8）+0.4 mL 10% TCA+0.4 mL 4% 2,2-聯(lián)吡啶+0.2 mL 3% FeCl3，測定吸光度值。

GSH含量的測定采用Nagalakshmi等[12]的DTNB檢測法；H2O2含量測定參照鄒琦[13]的方法；O2·-產(chǎn)生速率測定參照王愛國等[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所測得的數(shù)據(jù)用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對2種不同期海濱木槿幼苗SOD，APX和GR活性的影響

在鹽脅迫條件下抗氧化酶活性的變化趨勢可作為衡量細(xì)胞清除活性氧能力的重要指標(biāo)[12]。由圖1可知，150，300 mmol·L-1NaCl處理下，海濱木槿體內(nèi)SOD活性均顯著高于對照，隨著鹽濃度的增加，子葉期幼苗SOD活性呈先升高后下降的趨勢，而早期幼苗SOD活性表現(xiàn)出不斷上升的趨勢，表明一定濃度的NaCl處理可誘導(dǎo)SOD活性的增加。圖2，圖3顯示，2種不同時期海濱木槿幼苗的APX，GR活性與SOD活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢，表明在一定濃度鹽脅迫下海濱木槿可以維持較高的SOD，APX和GR活性，并且不同時期的海濱木槿對鹽度的敏感性不同。過高的鹽濃度使子葉期幼苗3種抗氧化酶活性下降，而早期幼苗在較高鹽濃度時抗氧化酶活性仍持續(xù)升高，表明此期幼苗較子葉期幼苗抗氧化能力增強(qiáng)。

圖2 不同濃度NaCl處理對2種不同期海濱木槿幼苗APX活性的影響Figure 2 Effect of NaCl treatment on APX activity of different stage of seedlings of H. hamabo

圖3 不同濃度NaCl處理對2種不同期海濱木槿幼苗GR活性的影響Figure 3 Effect of NaCl treatment on GR activity of different stage of seedlings of H.hamabo

2.2 NaCl脅迫對2種不同期海濱木槿幼苗抗氧化物質(zhì)含量的影響

從圖4可以看出，不同濃度NaCl處理下，子葉期海濱木槿幼苗AsA含量隨著NaCl濃度的升高表現(xiàn)出下降的趨勢，在300 mmol·L-1時最低；而早期幼苗中AsA含量與鹽濃度呈正相關(guān)，表明一定濃度的鹽脅迫可使此期的海濱木槿AsA合成能力增強(qiáng)。在相同NaCl濃度梯度（150，300mmol·L-1）處理下的海濱木槿，GSH含量表現(xiàn)出與AsA含量相同的變化趨勢（圖5），表明早期幼苗GSH合成能力得到提升，比子葉期幼苗具有了更強(qiáng)的耐鹽能力。

圖4 不同濃度NaCl處理對2種不同期海濱木槿幼苗AsA含量的影響Figure 4 Effect of NaCl treatment on AsA content of different stage of seedlings of H. hamabo

圖5 不同濃度NaCl處理對2種不同期海濱木槿幼苗GSH含量的影響Figure 5 Effect of NaCl treatment on GSH content of different stage of seedlings of H. hamabo

2.3 NaCl脅迫對2種不同期海濱木槿幼苗活性氧代謝的影響

由圖6，圖7結(jié)果顯示，在不同濃度NaCl處理下，海濱木槿子葉期幼苗和早期幼苗O2·-的產(chǎn)生速率和H2O2含量均隨鹽濃度的升高而呈不斷上升趨勢，且與對照差異顯著，在300 mmol·L-1時達(dá)到最高。這表明隨著鹽濃度升高，海濱木槿受害程度加深，加速了O2·-的產(chǎn)生速率，體內(nèi)H2O2積累量增加。

圖6 不同濃度NaCl處理對2種不同期海濱木槿幼苗 O2·-產(chǎn)生速率的影響Figure 6 Effect of NaCl treatment on O2·- rate of different stage of seedlings of H. hamabo

圖7 不同濃度NaCl處理對2種不同期海濱木槿幼苗H2O2含量的影響Figure 7 Effect of NaCl treatment on H2O2 content of different stage of seedlings of H. hamabo

3 結(jié)論與討論

高鹽逆境下植物體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡被打破，O2·-的產(chǎn)生速率和H2O2的含量會隨之增加[15]。SOD是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，可通過歧化反應(yīng)高效消除體內(nèi)積累的O2·-，將其轉(zhuǎn)化為H2O2后通過AsA-GSH循環(huán)被清除[16-17]。劉志禮等[8]對螺旋藻進(jìn)行NaCl脅迫處理，發(fā)現(xiàn)一定濃度NaCl處理下，螺旋藻體內(nèi)SOD活性升高。也有研究發(fā)現(xiàn)，100 mmol·L-1NaCl處理對海濱木槿種子萌發(fā)[18]及幼苗生長[6]均有顯著的抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度的 NaCl脅迫處理海濱木槿幼苗，SOD活性均顯著高于對照，這與何奇江等對雷竹 Phyllostachys praecox‘Prevernalis’進(jìn)行鹽脅迫處理得出的結(jié)論相一致[19]。子葉期海濱木槿SOD活性隨鹽濃度升高呈先升高后下降趨勢，早期幼苗SOD的活性則與鹽濃度呈正相關(guān)，可能是子葉期幼苗對鹽的耐受能力較弱，只能清除較低鹽濃度下產(chǎn)生的活性氧，當(dāng)子葉中ROS積累超過其清除限度時，植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致SOD活性下降。

APX，GR是AsA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶。APX定位于植物細(xì)胞的葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，是一種催化AsA捕捉H2O2的抗氧化酶，APX活性的增加有助于植物抗性的提高[20]。GR是與NADPH電子傳遞功能有關(guān)的一種黃素蛋白，可以利用NADPH作為反應(yīng)底物，將GSSG還原為GSH，是AsA-GSH循環(huán)中最后一步的關(guān)鍵性酶，對維持AsA和GSH的循環(huán)再生具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與海濱木槿早期幼苗中APX和GR活性隨鹽濃度升高而持續(xù)升高的趨勢不同，子葉期幼苗在不同濃度鹽處理下的兩種酶活性雖顯著高于對照，但在 300 mmol·L-1NaCl處理下兩種酶活性略有下降，可能是高鹽濃度下產(chǎn)生的過量活性氧攻擊了防御系統(tǒng)中的生物功能分子，使兩種酶遭受損傷。這進(jìn)一步表明子葉期海濱木槿只能耐受較低濃度的鹽脅迫，防御能力較弱，而早期幼苗耐鹽性提高。

AsA和GSH是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中重要的抗氧化劑，兩者通常協(xié)同作用來清除植物體內(nèi)過多的活性氧。AsA作為APX的反應(yīng)底物將H2O2還原成H2O，清除鹽脅迫產(chǎn)生的H2O2毒害[21]，而AsA被氧化形成MDHA和DHA，MDHA和DHA在MDAR和DHAR作用下循環(huán)再生AsA[22]；GSH含量的升高可以增強(qiáng)植物對逆境的抵抗力，也是植物對脅迫環(huán)境的一種應(yīng)激反應(yīng)，并且也有研究證實(shí)外源的GSH可以明顯提高植物活性氧清除系統(tǒng)中抗氧化劑含量和抗氧化相關(guān)酶的活性[23]。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，子葉期海濱木槿在較高濃度NaCl（300 mmol·L-1）處理下AsA和GSH含量下降，這可能與子葉期幼苗器官還未發(fā)育完全有關(guān)；而早期幼苗在鹽脅迫條件下可維持高水平的AsA，GSH含量以保證AsA-GSH循環(huán)的高效運(yùn)轉(zhuǎn)，有助于及時清除活性氧，這說明海濱木槿幼苗可能具備較高的AsA，GSH周轉(zhuǎn)和再生的能力以抵抗鹽脅迫造成的氧化損傷。不同濃度鹽處理下，海濱木槿子葉和葉片中O2·-的產(chǎn)生速率和H2O2的含量均隨NaCl濃度的升高而升高，表明鹽脅迫會引發(fā)氧化脅迫，導(dǎo)致子葉和早期幼苗中活性氧積累，而且鹽濃度越高，氧化損傷越嚴(yán)重。

綜上所述，不同生長時期的海濱木槿在遭遇鹽脅迫時，體內(nèi)均有高效協(xié)同的抗氧化防御機(jī)制，使其對鹽脅迫有一定的耐受性。其中，AsA-GSH循環(huán)在不同期海濱木槿幼苗應(yīng)答鹽脅迫中可能發(fā)揮了重要作用，并且從子葉期到早期幼苗，該循環(huán)系統(tǒng)逐步完善，有利于海濱木槿耐鹽能力增強(qiáng)。

[1] 呂新民，楊怡帆，魯曉燕，等. NaCl脅迫對酸棗幼苗AsA-GSH 循環(huán)的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2016，52（5）：736－744.

[2] 李曉云，王秀峰，呂樂福，等. 外源NO對銅脅迫下番茄幼苗根系抗壞血酸——谷胱甘肽循環(huán)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24（4）：1023－1030.

[3] 陳坤明，宮海軍，王鎖民. 植物抗壞血酸的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及其生物學(xué)功能[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（2）：329－336.

[4] 徐樹華. 海濱木槿的馴化試驗(yàn)及開發(fā)利用[J]. 浙江林業(yè)科技，1996，16（2）：33－36.

[5] 李會欣，吳明，方炎明，等. NaCl脅迫對海濱木槿葉片生理特性的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19（3）：55－61.

[6] 孫宏麗，商宏艷，姚葉，等. NaCl與KCl處理對海濱木槿生長特性的影響[J]. 山東林業(yè)科技，2011，41（6）：13－16.

[7] 薄鵬飛，孫秀玲，孫同虎，等. NaCl脅迫對海濱木槿抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（1）：113－118.

[8] 劉志禮，李鵬云. NaCl脅迫對螺旋藻生長及抗氧化酶活性的影響[J]. 植物學(xué)通報(bào)，1998，15（3）：43－47.

[9] NAKANO Y，ASADA K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts[J]. Plant Cell Physiol，1981，22（5）：867－880 .

[10] FOSTER J G，HESS J L. Responses of superoxide dismutase and glutathione reductase activities in cotton leaf tissue exposed to an atmosphere enriched in oxygen [J]. Plant Physiol，1980，66（3）：482－487.

[11] TANAKA K，SUDA Y，KONDO N，et al. O3 tolerance and the ascorbate-dependent H2O2decomposing system in chloroplasts[J]. Plant Cell Physiol，1985，26（7）：1425－1431.

[12] NAGALAKSHMI N. PRASAD M N V. Responses of glutathione cycle enzymes and glutathione metabolism to copper stress in Scenedesmusbijugatus[J]. Plant Sci，2001，160（2）：291－299.

[13] 鄒琦. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：159－170.

[14] 王愛國，羅廣華. 植物的超氧物自由基與羥胺反應(yīng)的定量關(guān)系[J]. 植物生理學(xué)通訊，1990，26（6）：55－57.

[15] ZHAO H，YE L，WANG Y，et al. Melatonin increases the chilling tolerance of chloroplast in Cucumber seedlings by regulating photosynthetic electron flux and the ascorbate-glutathione cycle[J]. Front Plant Sci，2016，7.

[16] MCCORD J M，F(xiàn)RIDOVICH I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein)[J]. J Biol Chem，1969，244（22）：6049－6055.

[17] 靳雯棋，畢英飛，王晶，等. 野山參與園參抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)代謝差異的比較[J]. 中草藥，2017，48（2）：373－376.

[18] 薄鵬飛，孫秀玲，宋杰，等. NaCl脅迫對海濱木槿種子萌發(fā)及Na+，K+含量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（8）：3098－3100.

[19] 何奇江，李楠，王波，等. 鹽脅迫對雷竹生理生化特性的影響[J]. 浙江林業(yè)科技，2011，31（1）：44－48.

[20] FOYER C H，NOCTOR G. Ascorbate and glutathione: the heart of the redox hub[J]. Plant Physiol，2011，155（1）：2－18 .

[21] SMIRNOFF N，WHEELER G L. Ascorbic acid in plants: biosynthesis and function[J]. Critic Rev Biochem Mol Biol，2000，35（4）：291-314.

[22] JIN Y H，TAO D L，HAO Z Q，et al. Environmental stresses and redox status of ascorbate[J]. Acta Bot Sin，2003，45（7）：795－801.

[23] 魯麗麗，劉耕，李君，等. 外源 GSH 對NaCl脅迫下二色補(bǔ)血草鹽害緩沖機(jī)理的研究[J]. 山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，21（2）：108－111.