施雨彤，徐 梁，鄭紹宇，顧翠花

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

千屈菜科Lythraceae植物有31個(gè)屬600多個(gè)種，大多數(shù)植物為草本，灌木或喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，千屈菜屬為本科模式屬，廣布于全世界，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國有1屬，約47屬種，南北均有[1]。根據(jù)植物形態(tài)、解剖和植物胚胎學(xué)角度證明其與柳葉菜科 Onagraceae在生物進(jìn)化過程中關(guān)系密切，同屬于桃金娘目Myrtiflorae[2]。千屈菜科紫薇屬 Lagerstroemia植物為落葉或常綠的喬木或灌木，根據(jù)國際植物名稱檢索表（International Plant Names Index）報(bào)道，雖部分種類存在爭議但數(shù)量達(dá)到近80種[3]。紫薇屬植物大多數(shù)種類花大色艷，樹形優(yōu)美可愛，夏季開花時(shí)間長，木質(zhì)優(yōu)良，紋理美觀，是園林造景、家具用材的優(yōu)良樹種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國內(nèi)外紫薇屬植物研究主要集中在新品種選育、繁殖、形態(tài)分類、生理生化等方面[4-6]。國內(nèi)關(guān)于紫薇葉綠體基因組內(nèi)含子的研究較少，而在植物進(jìn)化過程中基因的內(nèi)含子丟失現(xiàn)象廣泛發(fā)生。對鼠耳芥Arabidopsis thaliana的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子丟失與植物基因突變率有明顯相關(guān)性[7]，這為紫薇葉綠體基因組內(nèi)含子研究及紫薇育種在分子水平上提供了參考。

真核生物細(xì)胞基因 DNA中把編碼區(qū)域間隔開來的序列為內(nèi)含子（Intron），在基因轉(zhuǎn)錄后剪接去除[8]，內(nèi)含子作為真核生物基因組的組成部分，與基因表達(dá)過程關(guān)系密切，內(nèi)含子極大的豐富了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的數(shù)量和種類，并在mRNA剪接過程中起著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，從而影響基因表達(dá)[9-11]。內(nèi)含子的缺失在物種進(jìn)化過程中一直不斷發(fā)生，比如豆科Leguminosae山螞蝗族Trib. Desmodieae以及單子葉和雙子葉植物中均有記載[12-13]。rpl2基因（核糖體大亞基蛋白2，ribosomal protein gene 2）是葉綠體中組成RNA基因的核糖體蛋白大亞基基因，其編碼核糖體蛋白L2的過程是系統(tǒng)的關(guān)鍵，與植物的光合作用密切相關(guān)，對植物的抗性和生長發(fā)育起著重要作用。在基因種類和排序上，葉綠體DNA非常保守。在進(jìn)化過程中，cpDNA的某些結(jié)構(gòu)依然保持不變，為研究物種的進(jìn)化過程提供了行之有效的途徑。

有學(xué)者在屋久島紫薇Lagerstroemia fauriei葉綠體基因組研究的過程中，發(fā)現(xiàn)其rpl2基因的內(nèi)含子存在缺失現(xiàn)象[14]，因此，本研究對紫薇屬乃至千屈菜科進(jìn)行了取樣，針對內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)了引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序分析，來研究rpl2基因內(nèi)含子缺失發(fā)生在屬的水平還是科的水平，以期對后續(xù)研究紫薇系統(tǒng)發(fā)育過程中基因的變化提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究共采集9屬25種相關(guān)材料（表1），其中部分物種取自國外。

表1 實(shí)驗(yàn)樣本Table 1 Experimental samples

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用了與千屈菜科紫薇屬近緣的月見草屬Oenothera植物O. albicaulis作為參照，同時(shí)選取模式植物鼠耳芥、近緣科桃金娘科Myrtaceae的物種Angophora costata，Corymbia eximia，Eucalyptus aromaphloia，Eugenia uniflora，Stockwellia quadrifida , Syzygium cumini[15-20]等6種植物的樣品（表2）。取樣后立即投入液氮，于－80℃保存?zhèn)溆?。通過植物基因組DNA提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)樣本的總DNA，試劑盒為北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)。提取到25種樣本的合格DNA，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。部分實(shí)驗(yàn)樣品為國外采集，《中國植物志》中并未收錄，缺乏與之對應(yīng)的中文名稱，在表格中以拉丁文為準(zhǔn)，如 Angophora costata，Corymbia eximia，Eucalyptus aromaphloia，Eugenia uniflora，Stockwellia quadrifida and Syzygium cumini，Heimia salicifolia，Cuphea aequipetala，Oenothera albicaulis等；同時(shí)涉及新種如密毛紫薇，參照相關(guān)文獻(xiàn)，表中關(guān)于石榴屬的分類參照國際最新分類系統(tǒng)[16]，具體實(shí)驗(yàn)樣本名錄見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)樣本Table 2 Experimental samples

1.2 DNA序列的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中登錄的rpl2基因已知序列，設(shè)計(jì)了2對引物，正向引物（CAAAACTTCTACCCCAAGCA）和反向引物（TCTTCTTCCAAGTGCAGGAT），以基因組DNA作為模板對樣品進(jìn)行40 μL體系特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：4 μL 10×Taq buffer，0.8 μL dNTP（10 mM），0.4 μL Taq polymerase（5 U·μl-1），0.5 μL 上下游引物（20 pmol·μL-1），所有體系來自上海生工，0.5 μL DNA 模板和 33.3 μL ddH2O，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min；94℃變性45 s，55℃預(yù)變性45 s，72℃延伸45 s，72℃延伸2 min，共32個(gè)循環(huán)；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后量取8 μL反應(yīng)產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 PCR產(chǎn)物的回收

按照biomega純化試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收。

1.4 基因結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子信息分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的SIpidey[21]工具分析所獲得的rpl2基因結(jié)構(gòu)，并利用PlantCARE[22]對rpl2基因內(nèi)含子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 千屈菜科植物與月見草屬物種O. albicaulis rpl2基因比較

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增了紫薇屬的17種和千屈菜科內(nèi)其他7屬中的物種rpl2基因區(qū)域，同時(shí)也擴(kuò)增了千屈菜科外的一種月見草屬物種O. albicaulis作為對比參照。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果如圖1（樣品來自表1）。從圖1中可直觀地看出，不含有rpl2內(nèi)含子的目標(biāo)片段的長度約為750 bp，而O. albicaulis內(nèi)含子的完整片段約為1 400 bp，從片段的長度上直觀的說明了除O. albicaulis之外，千屈菜科植物存在rpl2基因內(nèi)含子缺失，除了缺失的內(nèi)含子之外，兩個(gè)外顯子部分與其他物種的外顯子序列存在高度相似性。

2.2 紫薇屬植物與千屈菜科內(nèi)其他物種的比較

同時(shí)對紫薇屬內(nèi)17個(gè)物種和千屈菜科內(nèi)其他7個(gè)物種的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測序，見圖2。由圖2測序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了rpl2基因內(nèi)含子在24種測試樣本（千屈菜科）中缺失。如圖2A所示，本研究選取對比了7種植物的rpl2基因結(jié)構(gòu)，包括模式植物鼠耳芥、近緣科桃金娘科的物種Angophora costata，Corymbia eximia，Eucalyptus aromaphloia，Eugenia uniflora，Stockwellia quadrifida and Syzygium cumini以及柳葉菜科月見草屬物種O. albicaulis，在這7個(gè)物種的rpl2基因中，兩個(gè)外顯子之間都包含一個(gè)660 bp左右的內(nèi)含子，圖2B為這7個(gè)物種的內(nèi)含子兩個(gè)邊界的部分外顯子序列，圖2C主要對千屈菜科代表物種進(jìn)行了rpl2基因的測序，藍(lán)色背景區(qū)域與黃色背景區(qū)域均為外顯子序列，中間未出現(xiàn)任何核苷酸。測序結(jié)果與比對證明rpl2基因內(nèi)含子在紫薇屬內(nèi)發(fā)生了缺失現(xiàn)象。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Figure 1 Result of electrophoresis test of PCR

圖2 rpl2基因測序結(jié)果Figure 2 Result of gene sequencing

3 結(jié)論與討論

本研究通過收集的25種樣本，其中紫薇屬樣本17種，千屈菜科其它屬7種，利用柳葉菜科月見草屬物種O. albicaulis為對照。通過試劑盒法提取DNA，并PCR擴(kuò)增樣本rpl2目標(biāo)區(qū)域基因片段，利用PCR擴(kuò)增測序測出實(shí)驗(yàn)樣本的rpl2目標(biāo)區(qū)域長度短于非千屈菜科植物，對擴(kuò)增片段的Sanger測序結(jié)果進(jìn)行比對，確認(rèn)rpl2內(nèi)含子缺失現(xiàn)象發(fā)生在紫薇屬及千屈菜科內(nèi)。通過分子生物學(xué)的研究，了解其基因組信息所對應(yīng)的性狀以及其進(jìn)化歷程，對培育紫薇新品種提供一定的基礎(chǔ)。

之前的研究表明80%～85%的高等植物的葉綠體基因組都有內(nèi)含子，但是不同物種內(nèi)含子數(shù)目不同[18]。陸生植物的葉綠體基因組在進(jìn)化上相對保守，其基因內(nèi)容，基因順序，結(jié)構(gòu)和大小變化都比較小，即便在苔蘚植物中大量內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)仍與鼠耳芥Arabidopsis thaliana相同[10,23-24]。由于數(shù)量較少，其基因組的主要結(jié)構(gòu)突變（如倒置，插入或基因和內(nèi)含子的缺失等）通?？梢詾樘囟ㄖ参锶郝涞膯蜗颠M(jìn)化提供強(qiáng)有力的證據(jù)。

內(nèi)含子的大量丟失導(dǎo)致葉綠體基因組主要結(jié)構(gòu)的突變、縮小[24]。同時(shí)根據(jù)突變率與內(nèi)含子丟失的相關(guān)性可以推斷出，高突變率的基因?qū)е碌膬?nèi)含子丟失速率更高，同時(shí)相應(yīng)的內(nèi)含子的丟失有時(shí)也會(huì)影響基因的表達(dá)效應(yīng)，造成表型的變化[25]。內(nèi)含子多態(tài)點(diǎn)位可以作為植物性狀篩選的分子指標(biāo)，千屈菜科紫薇屬內(nèi)rpl2內(nèi)含子的缺失研究結(jié)果可以在后續(xù)研究中作為性狀篩選的指導(dǎo)。內(nèi)含子通過mRNA介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄重組丟失，根據(jù)內(nèi)含子丟失已知模型，內(nèi)含子的準(zhǔn)確丟失在較長的基因中檢測到具有位置偏好性[26]。內(nèi)含子的丟失在一定程度上反映了物種進(jìn)化速率；進(jìn)化較快的物種保留更少的祖先內(nèi)含子[27,28]，該研究中千屈菜科紫薇屬以及其他屬的植物都發(fā)生內(nèi)含子丟失，后續(xù)可以通過內(nèi)含子多態(tài)性位點(diǎn)、物種相同基因內(nèi)含子的丟失來鑒定植物進(jìn)化程度。

rpl2內(nèi)含子并不存在于所有的陸生植物。DNA測序結(jié)果表明rpl2內(nèi)含子存在于茄科Nicotiana debneyi中，但在菠菜Spinacia oleracea中未發(fā)現(xiàn)。隨后的研究顯示，rpl2內(nèi)含子在被檢測的6種陸生植物的葉綠體DNA中存在，其中包括2種雙子葉植物，3種單子葉植物和一種苔蘚類植物。這6種陸生植物的內(nèi)含子的同源性是通過其在基因中的保守位置和其高度保守的一級序列來表示。因此，rpl2內(nèi)含子存在于被子植物的共同祖先中，但隨后消失在譜系中，從而導(dǎo)致了菠菜中rpl2內(nèi)含子的缺失[11]。

目前已經(jīng)確定rpl2基因分布于116科390種被子植物中。rpl2內(nèi)含子的缺失現(xiàn)象已經(jīng)在雙子葉植物的其他五個(gè)科中出現(xiàn)，虎耳草科Saxifragaceae，旋花科Convolvulaceae，睡菜科Menyanthaceae，牻牛兒科Geraniaceae的兩個(gè)屬，和茅膏菜科Droseraceae的一個(gè)屬。該內(nèi)含子缺失表明千屈菜科植物和采樣的其他千屈菜科其他屬的種存在結(jié)構(gòu)上的差異。由此可知，在物種進(jìn)化過程中rpl2基因內(nèi)含子已經(jīng)發(fā)生了多次獨(dú)立的缺失[14,29]。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì). 中國植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1983，52（2）：62.

[2] GRAHAM S A，HALL J，SYSMA K，et al. Phylogenetic analysis of the Lythraceae based on four gene regions and Morphology[J]. Int J Plant Sci，2005，166（6）：995－1017.

[3] 張潔，王亮聲，張晶晶，等. 紫薇屬植物研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2007，34（1）：251－256.

[4] 張啟翔. 紫薇品種分類及其在園林中的應(yīng)用[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，13（4）：57－66.

[5] 賈文慶，劉會(huì)超，姚連芳. 紫薇花粉萌發(fā)特性研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22（6）：18－20.

[6] 童俊，葉要妹，馮彪，等. 秋水仙素誘導(dǎo)三種紫薇多倍體的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2009，36（1）：127－132.

[7] 楊宇飛. 鼠耳芥和琴葉鼠耳芥中內(nèi)含子丟失和突變率關(guān)系[D]. 北京：北京師范大學(xué)，2013，10－20.

[8] Alberts B，Johnson A D，LEWIS J. Molecular biology of the cell [J]. Garland Sci，2008，10（9）：8153－4072.

[9] 王玲平. 不同生物中內(nèi)含子大小和豐度系統(tǒng)分析[D]. 北京：中國科學(xué)院大學(xué)，2014.

[10] KREBS J E，GOLDSTEIN E S，KILPATRICK S T. Lewin’s Gene X [M].Beijing: Science Press，2009：58－62.

[11] CHOW L T，GELINAS R E，BROKER T R，et al. An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA[J]. Cell，1977，12（1）：1－8.

[12] DOWNIE S R，OLMSTEAD R G，ZURAWSKI G，et al. Six independent losses of the chloroplast DNA rpl2 intron in Dicotyledons: molecular and phylogenetic implications[J]. Evolution，1991，45：1245－1259.

[13] BAILEY C D，DOYLE J J，KAJITA T，et al. The Chloroplast rpl2 intron and ORF184 as phylogenetic markers in the Legume Tribe Desmodieae[J]. Syst Bot，1997，22：133－138.

[14] GU C H，TEMBROCK L R，JOHNSON N G，et al. The complete plastid genome of Lagerstroemia fauriei and loss of rpl2 intron from Lagerstroemia (Lythraceae)[J]. Plos One，2016，11（3）：1－18.

[15] GRAHAM S A，HALL J，SYTSMA K，et al. Phylogenetic analysis of the Lythraceae based on four gene regions and morphology[J]. Int J Plant Sci，2005，166（6）：995－1017.

[16] HILL K D，JOHNSON L A S. Systematic studies in the eucalypts7. A revision of the bloodwoods, genus Corymbia (Myrtaceae)[J]. Telopea，1995，6（2－3）：185－504.

[17] CHAPPILL J，LADIGES P Y，BOLAND D. Eucalyptus aromaphloia Pryor & Willis-a redifinition of geographical and morphological boundaries[J]. Aust J Bot，1986，34（4）：395－412.

[18] TURCHETTO-ZOLET A C，SALGUEIRO F，TURCHETTO C，et al. Phylogeography and ecological niche modelling in Eugenia uniflora(Myrtaceae) suggest distinct vegetational responses to climate change between the southern and the northern Atlantic Forest[J]. Bot J Lin Soc，2016，182（3）：670－688.

[19] CARR D J，CARR S G M，HYLAND B P M，et al. Stockwellia quadrifida (Myrtaceae), a new Australian genus and species in the eucalypt group[J]. Bot J Lin Soc，2015，139（4）：415－421.

[20] HELMST?DTER A. Syzygium cumini (L.) Skeels（Myrtaceae）against diabetes-125 years of research [J]. Pharmazie，2008，63（2）：91－101.

[21] KAPUSTIN Y，SOUVOROV A，TATUSOVA T，et al. Splign: algorithms for computing spliced alignments with identification of paralogs[J].Biol Direct，2008，3（1）：20.

[22] LESCOT M，DéHAIS P，THIJS G，et al. A database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences [J]. Nucl Acids Res，2002，30（1）：325－327.

[23] 楊楨. microRNA相關(guān)的生物信息學(xué)與進(jìn)化分析[D]. 上海：復(fù)旦大學(xué)，2011，80－90.

[24] ROESLER K R，SSHORROSH B S，OHLROGGE J B. Structure and expression of an Arabidopsis actyle-coemzyme A carboxylase gene[J].Plant Physiol，1994，105：611－617

[25] 陳兵，文建凡. 內(nèi)含子在生物信息學(xué)研究和基因工程中的應(yīng)用[J]. 生命的化學(xué)，2010，30（1）：59－63.

[26] ROY S W，PENNY D. Patterns of intron loss and gain in plants: intron loss-dominated evolution and genome-wide comparison of O. sativa and A. thaliana[J]. Mol Biol Evolut，2007，24（1）：171－181.

[27] 金谷雷. 內(nèi)含子進(jìn)化模式研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2007，29－32.

[28] 張尚宏，屈良鵠. 基因組的進(jìn)化與內(nèi)含子中的基因的進(jìn)化[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，38（1）：50－52.

[29] 靳霞，呂占軍. 內(nèi)含子的進(jìn)化及基因表達(dá)調(diào)節(jié)[J]. 生命的化學(xué)，2008，28（1）：33－35.