萬岷金相廷張幸 黃俊 陳桂林 夏紅枝 李東洋 盧振剛 劉希娥

股骨頭缺血性壞死臨床十分常見，常用治療方法包括早期自體腓骨打壓植骨等保頭治療和晚期金屬假體置換。早期的各種保頭療法效果并不確定，我們認為其原因在于無法解決壞死區(qū)域的再血管化問題。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）屬于多功能干細胞，具有多項分化潛能，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為骨、內(nèi)皮、脂肪、肌肉、韌帶等多種組織細胞，可作為種子細胞用于修復(fù)損傷的組織器官[1-3]。有學(xué)者研究證實促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）可以促進hMSCs增殖并向血管內(nèi)皮細胞分化，促進血管的形成[4-6]。本研究旨在觀察hMSCs與同種異體骨材料共培養(yǎng)細胞增殖情況及在EPO誘導(dǎo)下干細胞向血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化的情況，以期為股骨頭缺血壞死的早期治療探索一種新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料來源

同種異體骨材料（北京大清生物），凍存人骨髓間充質(zhì)干細胞（human mesenchymalstem cells,hMSCs,廣州賽業(yè)生物）。

1.1.2 主要試劑和儀器

Cell Counting Kit-8試劑（日本Dojindo公司），hMSC完全培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物），離心機（美國Beckman公司），離心管，恒溫水浴箱（上海恒一公司），細胞培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），移液器（德國Eppendrof公司），PBS（武漢博士德），0.25%胰酶（美國ThermoFisher公司），促紅細胞生成素（EPO，美國 Peprotech公司），4%多聚甲醛（武漢博士德），兔抗 von willebrand factor(VWF)多克隆抗體（美國 Santacruz公司），兔抗血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)多克隆抗體（美國CST公司），兔抗血小板內(nèi)皮細胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1）多克隆抗體（美國 Santacruz公司），熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖率測定

取凍存hMSCs一支，放入37℃水浴箱中解凍，800 rpm，室溫下離心5 min，吸取上清液，加入1 mL新鮮hMSC完全培養(yǎng)基，吹散細胞沉淀，移入25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入2 mL培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。第二天復(fù)蘇細胞換液，其后每2～3天換液，待細胞融合率達90%，將細胞培養(yǎng)瓶中的細胞用0.25%胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基制成10000個/mL的細胞懸液。將骨材料反復(fù)雙蒸水沖洗浸泡后切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，放入96孔板中。將細胞懸液加入孔中，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。96孔板中以添加骨材料者為實驗組，未添加者為對照組，每組8孔。接種細胞1，2，3，4天后，將CCK-8(CellCounting Kit-8)用培養(yǎng)基1∶10稀釋備用，吸去孔中舊培養(yǎng)基，每孔中加入100 uL稀釋好的CCK-8，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，每孔吸出90 uL至新的96孔板中，用酶標(biāo)儀測量450 nm波長吸光度值（OD值），測得的OD值（A450 nm）與細胞增殖數(shù)成正比。每個時間節(jié)點各組均取5孔測量并計算增殖率。

hMSCs增殖率=（各時間點細胞總數(shù)－首日接種存活細胞數(shù)）/首日接種存活細胞數(shù)×100%

1.2.2 誘導(dǎo)實驗

材料組（A組）將同種異體骨材料反復(fù)雙蒸水沖洗浸泡后切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，放入15 mL離心管中。將細胞培養(yǎng)瓶中細胞用0.25%胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基制成10000個/mL的細胞懸液，用移液器吸取400uL細胞懸液，加入骨材料中，放入 37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。12 h后待細胞貼壁，每個離心管中分別加入1 mL正常培養(yǎng)基和1 mL含EPO濃度為1ng/mL的培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。非材料組（B組）離心管中不加入骨材料，其余同A組。非誘導(dǎo)組（C組）離心管中加入骨材料，但不加入EPO，其余同A組。各組每3天換液一次，連續(xù)60天。將各離心管中細胞用0.25%胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基制成1000個/mL的細胞懸液，將細胞懸液滴入預(yù)先準(zhǔn)備好的細胞爬片上，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。2天后細胞已在爬片上完全伸展，吸取培養(yǎng)基，用 PBS漂洗一次，加入4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定。各組均制作24張爬片。對PECAM-1、VEGF、VWF三種標(biāo)記物進行免疫熒光染色，每種標(biāo)記物每組抽取8張爬片染色，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 圖像軟件分析

應(yīng)用ImageJ1.51k圖像分析軟件（NationalInstitutesofHealh,USA）進行細胞數(shù)量評估。每張爬片均隨機抽取一張視野照片，應(yīng)用軟件測量視野中細胞個數(shù)，并除以測量面積，從而得到相對細胞密度值，用以估算各組所觀察細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，資料數(shù)據(jù)以（±s）表示。增殖率各時間點兩組間比較采用配對樣本 檢驗，誘導(dǎo)實驗各組間比較采用隨機區(qū)組設(shè)計資料的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 移植后干細胞增殖率

干細胞移植后2～4天，可見兩組hMSCs細胞增殖數(shù)量均隨培養(yǎng)時間逐漸增加，第4天，實驗組及對照組增殖率分別為（486.74±33.84）%，（489.47±59.34）%。各時間點實驗組與對照組細胞增殖率無明顯差異（值均＞0.05，見圖1）。說明同種異體骨材料與hMSCs共培養(yǎng)條件下，同種異體骨材料對hMSCs增殖無明顯影響。

圖1，兩組孔板接種hMSCs細胞后不同時間點細胞增殖率比較。

2.2 EPO誘導(dǎo)干細胞情況

2.2.1 免疫熒光染色觀察

熒光顯微鏡下觀察可見C組三種標(biāo)記物均無明顯表達，A組及B組血管內(nèi)皮細胞標(biāo)記物PECAM-1、VEGF、VWF熒光染色均有表達，陽性細胞發(fā)出高亮紅色熒光。且A組、B組熒光表達情況與C組對比差異明顯（見圖2-4）。說明在hMSCs與同種異體骨材料共培養(yǎng)情況下，EPO對hMSCs仍有明顯的成血管誘導(dǎo)作用，而單獨應(yīng)用同種異體骨材料并不能顯著促使hMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化。

圖2，免疫熒光染色PECAM-1表達情況（彩圖見插頁）。

圖3，免疫熒光染色VWF表達情況（彩圖見插頁）。

圖4，免疫熒光染色VEGF表達情況（彩圖見插頁）。

2.2.2 圖像分析軟件分析結(jié)果

ImageJ圖像分析軟件進行熒光染色粒子計數(shù)。A組PECAM-1、VEGF、VWF三種血管內(nèi)皮標(biāo)記物陽性細胞數(shù)（分別為 174.13±28.02/mm2，487.38±43.09/mm2，375.25±44.12/mm2）均明顯高于C 組（分別為 44.50±18.81/mm2，63.13±18.90/mm2，41.62±10.06/mm2，均＜0.01），但A組與B組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（均＞0.05，見圖5）。說明同種異體骨材料對于EPO的誘導(dǎo)hMSCs成血管作用無明顯影響。

圖5，血管內(nèi)皮標(biāo)記物表達情況。

3 討論

我國已進入老齡化社會，臨床上股骨頭缺血壞死的發(fā)生率也逐年增高。股骨頭缺血壞死可以造成髖關(guān)節(jié)疼痛并影響髖關(guān)節(jié)的活動功能，可導(dǎo)致股骨頭塌陷并形成骨性關(guān)節(jié)炎[7-9]。目前股骨頭壞死的具體發(fā)病機制仍不十分明確，但目前普遍認為與多種因素引起的股骨頭血供障礙密切相關(guān)[10,11]。研究表明股骨頭髓芯鉆孔減壓聯(lián)合自體骨髓細胞注射移植治療早期股骨頭缺血壞死與單獨鉆孔減壓相比可以提高治療髖關(guān)節(jié)疼痛、活動障礙等方面的效果[12,13]。這可能與hMSCs的成血管效應(yīng)最終促進了局部循環(huán)的改善有關(guān)。EPO一般情況下由腎臟的腎小管旁細胞分泌，可促進紅細胞的增殖，EPO還可促進hMSCs增殖，并促進hMSCs向血管內(nèi)皮分化，引導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞歸巢，促進血管形成。同時有研究表明 EPO還可促進血管內(nèi)皮生長因子的表達并可抑制成骨細胞、骨細胞的凋亡[14]。臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)植入干細胞需要良好的支架，否則無法解決細胞在植入?yún)^(qū)的定植及分化，同種異體骨經(jīng)過醫(yī)學(xué)處理后排異性最小，其松質(zhì)骨的孔洞也有利于細胞附著及新生組織長入，因此，如果能夠在股骨頭缺血壞死的早期手術(shù)清除壞死骨組織，植入復(fù)合hMSCs的同種異體骨材料，并通過 EPO誘導(dǎo)使 hMSCs向血管內(nèi)皮遷延、分化，促使血管形成，勢必可以改善骨壞死、骨缺損的局部血液循環(huán)，增加營養(yǎng)供應(yīng)，從而提高疾病的治療效果。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)參與血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，對血管的發(fā)生形成起著至關(guān)重要的作用[15]。血小板內(nèi)皮細胞粘附分子（PECAM-1)又稱CD31，是一種內(nèi)皮細胞連接分子，廣泛分布于血管細胞[16]。血管性血友病因子(VWF)是由血管內(nèi)皮細胞分泌的一種糖蛋白，有著重要的止血作用，可促進血小板的粘附和聚集，并可與凝血因子Ⅷ結(jié)合起到穩(wěn)定因子Ⅷ的作用[17]。相關(guān)研究中也常將PECAM-1、VWF作為血管內(nèi)皮標(biāo)記物進行檢測。本實驗通過將hMSCs與同種異體骨材料體外共培養(yǎng)，結(jié)果顯示hMSCs的增殖情況良好，說明同種異體骨材料不會影響hMSCs的正常存活及增殖。在hMSCs與同種異體骨材料體外共培養(yǎng)條件下通過加入EPO誘導(dǎo)，對PECAM-1、VWF、VEGF三種標(biāo)記物進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示此三種標(biāo)記物表達情況良好，說明EPO對hMSCs仍有明顯的成血管誘導(dǎo)作用。但是本研究也存在一定的局限性，雖然觀察到有多種血管標(biāo)記物的表達，但是復(fù)合材料是否可在生物體內(nèi)確實促進血管形成仍需相關(guān)實驗進行驗證。hMSCs可以在同種異體骨材料中正常存活、增殖，并在EPO誘導(dǎo)下向血管內(nèi)皮細胞方向分化，這為骨壞死、骨缺損等疾病的治療材料選擇提供了一個新的研究方向。但是如何將hMSCs與同種異體骨材料更好的復(fù)合實用化、更好的加以成血管誘導(dǎo)、促進細胞增殖，仍需進一步探索、研究。

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