唐一梅，張 博，房海娜，張 彥

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 陜西 西安 710021)

石菖蒲是天南星多年生草本植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott.)的干燥根莖。味辛性溫,具芳香之氣,既能芳香化濕、醒脾健胃,又可化濁祛痰、開竅寧神,是芳香寧神,滌痰開竅之藥[1]。石菖蒲主要活性成分為石菖蒲揮發(fā)油,其具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性[2]、抗血栓作用[3]、可減輕低氧誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞線粒體損傷[4]、防治阿爾茨海默病[5]、體外抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用[6]、促進(jìn)羅丹明123的腸吸收[7]、還具有抗動脈硬化、抗抑郁等[8]。石菖蒲揮發(fā)油提取常采用的溶劑體系為水、超臨界CO2流體,采用的方法有水蒸氣蒸餾、水煎、超臨界[9-11],離子液體作為繼水和超臨界二氧化碳后的又一大類綠色溶劑,但將離子液體用于石菖蒲揮發(fā)油提取方面的研究未見報(bào)道。

離子液體是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成的一種低溫熔鹽,具有獨(dú)特的物理化學(xué)屬性,如良好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、幾乎沒有蒸汽壓、良好的傳熱與傳質(zhì)性能、對很多有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)表現(xiàn)出良好的溶解能力、結(jié)構(gòu)可修飾性等[12-14],以及修飾和改變陰陽離子的結(jié)構(gòu)和種類來控制離子液體的物理化學(xué)性質(zhì)。作為“綠色溶劑”,離子液體在天然產(chǎn)物的分離分析方面的應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn)[15],特別是其在中藥活性成分提取方面引起了研究者的廣泛關(guān)注,如揮發(fā)油[16]、有機(jī)酸[17-18]、生物堿[19]、木質(zhì)素[20-21]、黃銅[22-23]、香豆素[24]等的提取,但是目前有關(guān)離子液體用于活性成分提取方面研究仍然很少。

本研究以1-烷基-3-甲基咪唑類離子液體為輔助溶劑,通過改變離子液體種類、離子液體加入量,加入方式,并與傳統(tǒng)石菖蒲揮發(fā)油提取方法比較,研究提取條件對石菖蒲揮發(fā)油提取率的影響。建立離子液體輔助提取石菖蒲中揮發(fā)油的提取方法。研究離子液體在石菖蒲揮發(fā)油提取中可能的作用機(jī)制,為未來離子液體在中藥提取方面的應(yīng)用提供重要的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 儀器、試劑與藥品

1-烷基-3-甲基咪唑類離子液體(自制),丙酮(利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司,色譜純),無水硫酸鈉(AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);石油醚(AR,沸程30～60℃,利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司);其他試劑均為分析純。石菖蒲(經(jīng)藥學(xué)院生藥教研室張彥老師顯微鑒別為天南星科菖蒲屬石菖蒲AcorustatarinowiiSchott.的干燥根莖):恒溫干燥粉碎,過4號篩(篩孔內(nèi)徑為250 μm±9.9 μm)。

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Agilent 5975C/7890A GC-MS聯(lián)用儀(美國Agilent公司)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 石菖蒲揮發(fā)油的提取及提取率計(jì)算

2.1.1 純水溶液提取 稱取10 g石菖蒲藥材粉末,藥材質(zhì)量(g)與水的體積(mL)比為1∶8,超聲15 min (20℃，200 W),浸泡2 h,水蒸氣蒸餾法提取6 h[25]。收集揮發(fā)油,加入石油醚萃取,無水硫酸鈉脫水,過濾,40℃旋蒸除去石油醚。計(jì)算提取率,根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定方法計(jì)算。

(1)

式中:m表示揮發(fā)油的質(zhì)量，g；M表示藥材的質(zhì)量，g。

2.1.2 NaCl水溶液提取 稱取10 g石菖蒲藥材粉末,藥材質(zhì)量(g)與NaCl水溶液的體積(mL)比為1∶8,加入NaCl的量分別為藥材量的5%，10%，15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),超聲15 min(20℃, 200W),浸泡2 h,水蒸氣蒸餾法提取6 h,收集揮發(fā)油,后處理同2.1.1。依據(jù)公式(1)計(jì)算揮發(fā)油提取率。

2.1.3 不同離子液體種類、比例、加入方式

1) 不同離子液體種類

稱取10 g石菖蒲藥材粉末,藥材質(zhì)量(g)與離子液體-水溶液的體積比為1∶8,離子液體與水的體積比為1∶60,分別量取等量的1-辛基-3-甲基咪唑溴鹽([OMIM]Br)，1-己基-3-甲基咪唑溴鹽([HMIM]Br)，1-丁基-3-甲基咪唑溴([BMIM]Br)，1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([HMIM]BF4)，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4)，1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([OMIM]PF6)作為輔助提取劑,加入圓底燒瓶,浸泡2 h,水蒸氣蒸餾法提取6 h,收集揮發(fā)油,后處理同2.1.1,依據(jù)公式(1)計(jì)算各離子液體輔助提取揮發(fā)油的提取率。

2) 離子液體與水比例的選擇

以[OMIM]Br為輔助提取劑, 設(shè)定離子液體與水的體積比分別為1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶30, 1∶ 50, 1∶60,混合后加入燒瓶,浸泡2 h,水蒸汽蒸餾法提取6 h。收集揮發(fā)油,后處理同2.1.1,按公式(1)計(jì)算離子液體、水不同體積比時(shí)揮發(fā)油的提取率。

3) 離子液體加入方式的選擇

稱取10 g石菖蒲藥材粉末,按離子液體與水的體積比為1∶10,1∶20,1∶30，先加入[OMIM]Br,浸泡,攪拌1 h,再按比例加入水浸泡2 h,提取6 h后處理同2.1.1,按公式(1)計(jì)算揮發(fā)油的提取率。

2.2 供試品溶液制備

取100 μL揮發(fā)油,用丙酮定容至10 mL容量瓶,得10 μL/mL揮發(fā)油溶液;再取500 μL定容至10 mL容量瓶中,得0.5 μL/mL樣品溶液;加入無水硫酸鈉后,過0.45 μm濾膜,得供試品溶液。

2.3 GCMS條件

GC Agilent HP-5MS 色譜柱 (30m×250 μm×0. 25 μm),進(jìn)樣口溫度 250℃,接口溫度280℃,載氣為氦氣,流速1.0 mL/min,分流比為10∶1,進(jìn)樣量為1.0 μL;升溫程序:起始溫度50℃,6℃/min程升到130℃,然后1℃/min程升到160℃,保持2 min,再20℃/min程升到260℃,保持2 min。

MS:EI離子源,電子轟擊能量70 eV,離子源溫度230℃,四極桿溫度150℃,接口溫度280℃,溶劑延遲時(shí)間3 min,質(zhì)量范圍35～450 aum全程掃描。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同提取溶劑對揮發(fā)油提取率的影響

研究發(fā)現(xiàn),用水提取時(shí),石菖蒲揮發(fā)油的提取率為1.58%;NaCl的量為藥材量的5%，10%，15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),揮發(fā)油的提取率分別為0.93%，2.16%和1.11%(n=3, RSD≤3%)。結(jié)果提示,NaCl的量為藥材量的10%提取率最佳,且高于水作為溶劑時(shí)的提取率。當(dāng)NaCl的量為藥材量的5%，15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),揮發(fā)油的提取率比水溶液提取率小。原因是揮發(fā)性成分包含水溶性和油溶性成分,當(dāng)NaCl量小時(shí),阻礙水溶性成分從藥材向水中遷移;當(dāng)NaCl量適中時(shí),利于油溶性成分從水中析出;當(dāng)NaCl量更大時(shí),又阻礙了油溶性成分從藥材向水中遷移。

比較水、NaCl水溶液、[OMIM]Br浸泡和[OMIM]Br-水(體積比1∶20)4種溶劑體系對石菖蒲揮發(fā)油的提取率,發(fā)現(xiàn)[OMIM]Br-水(體積比1∶20)(>[OMIM]Br浸泡> NaCl水溶液>水(n=3, RSD≤4%)。這是由于離子液體具有破壞纖維素,溶解細(xì)胞壁的作用,在浸泡過程中使揮發(fā)油更易從植物進(jìn)入到提取液中,使提取率增加。加NaCl起到鹽析作用,降低了揮發(fā)油在水中的溶解度,使飽和蒸氣壓中揮發(fā)油含量增加。由于純的[OMIM]Br黏度較大,浸泡時(shí)易聚集,不易分散,揮發(fā)油被包裹于其中,而不易完全隨水蒸氣蒸餾出來。

3.2 不同離子液體對揮發(fā)油提取率的影響

離子液體與水體積比例為1∶60時(shí),[BMIM]Br，[HMIM]Br，[OMIM]Br，[BMIM]BF4，[HMIM]BF4和[OMIM]PF6離子液體對石菖蒲揮發(fā)油的提取率分別為1.79%，2.23%，2.69%，0.42%，0.70%和0.69%(n=3, RSD≤4%)。與水作溶劑提取率相比,實(shí)驗(yàn)中所用的6種離子液體中,N-甲基咪唑類溴離子液體能夠提高石菖蒲中揮發(fā)油的提取率。隨著烷基鏈長的增長,揮發(fā)油的提取率增加,[OMIM]Br離子液體的提取率最佳;N-甲基咪唑類四氟硼酸鹽和1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽均使揮發(fā)油的提取率降低。其主要原因有兩個(gè)方面:離子液體影響揮發(fā)性成分的傳質(zhì),即從藥材向溶劑體系的轉(zhuǎn)移;離子液體與揮發(fā)油間的作用力影響其在水蒸汽中的分配。離子液體[RMIM]PF6，[RMIM]Br，[RMIM]BF4的極性依次增大。依據(jù)相似相溶原理,[RMIM]PF6的提取率應(yīng)最佳,但由于[RMIM]PF6的極性過小,與揮發(fā)油的作用力最強(qiáng),使得揮發(fā)油很難被水蒸氣帶出。[RMIM]BF4為水溶性離子液體,不能將更多的揮發(fā)油從植物組織中帶出來,提取效果不佳。[RMIM]Br的極性隨烷基鏈的增長,疏水性增強(qiáng),與揮發(fā)油的作用增強(qiáng),[RMIM]Br又溶于水,起到表面活性劑的作用,再加上離子液體破壞纖維素,溶解細(xì)胞壁和傳質(zhì)作用,使更多的揮發(fā)油被提取出來,從而使揮發(fā)油的提取率明顯增加。

3.3 離子液體與水的比例對揮發(fā)油提取率的影響

以[OMIM]Br離子液體為輔助提取劑, 離子液體與水的體積比例分別為1∶60， 1∶50， 1∶30， 1∶20，1∶10，1∶5,揮發(fā)油的提取率分別為1.67%，3.61%，3.95%，3.63%，3.38%和2.69%(n=3, RSD≤5%),均高于水作溶劑時(shí)的提取率。結(jié)果提示,揮發(fā)油的提取率隨著離子液體的比例增大而增加,當(dāng)離子液體與水體積比為1∶20時(shí),揮發(fā)油的提取率最佳,繼續(xù)增加[OMIM]Br的量,揮發(fā)油的提取率隨著[OMIM]Br的增大而減小。同時(shí)，對離子液體加入方式研究發(fā)現(xiàn),[OMIM]Br離子液體與水混合浸泡藥材后,揮發(fā)油提取率明顯高于[OMIM]Br浸泡藥材再與水混合的加入方式(表1)。

表1 離子液體加入方式對揮發(fā)油提取率的影響(n=3)Tab. 1 Effect of ionic liquid adding method on the extraction rate of Acorus tatarinowii Schott. volatile oil (n=3)

由于[OMIM]Br具有一定的黏度,隨著[OMIM]Br在水中比例的增加,黏度越來越大,從而使離子液體在水中的分散能力變差,易于聚集。先加入離子液體,聚集的離子液體包裹在藥材粉末上,使揮發(fā)性成分難以蒸出。

3.4 揮發(fā)油化學(xué)成分分析

吸取水、NaCl-水、[OMIM]Br-水(體積比1∶60)和[OMIM]Br-水(體積比1∶20)提取的供試品溶液各1 μL分別進(jìn)樣分析。采用NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對圖譜進(jìn)行檢索,鑒定了4種提取溶劑中共同存在有的30個(gè)化合物,見表2,不同溶劑體系的GC-MS圖見圖1A～圖1D。

圖1A～圖1D中含量最高的7種化合物,含量分析結(jié)果見表3。

表2 石菖蒲揮發(fā)油化學(xué)成分Tab.2 Chemical components of volatile oil in Acorus tatarinowii Schott.

續(xù)表2

編號 保留時(shí)間/min 化合物 分子式 2748.096 Fenreinide C26H33NO2 2848.364 冠裸穗豚草素Coronopilin C15H20O4 2948.573 正三十七醇1-Heptatriacotanol C37H76O 3048.947乙基-異別膽Ethyl iso-allocholate C26H44O5

A 水; B 水-10%NaCl; C [OMIM]Br-水(體積比1∶60);D. [OMIM]Br-水(體積比1∶20) 1 甲基異丁香酚; 2 丁香酚甲醚; 3 菖蒲酮; 4 欖香脂素; 5 β-細(xì)辛醚;6 α-細(xì)辛醚; 7 1-異丙基-4,8-二甲基螺[4,5]癸-8-庚-7-單; 8 脫羥基異水菖蒲二醇 圖1 4種溶劑提取的石菖蒲揮發(fā)油GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS chromatograms for Acorus tatarinowii Schott. volatile oil

標(biāo) 號樣 品不同提取溶劑主要化學(xué)成分質(zhì)量百分含量(%, RSD≤5%) 水水-10%NaCl[OMIM]Br-水(體積比1∶60)[OMIM]Br-水(體積比1∶20)1甲基異丁香酚5.719.585.51±0.027.31±0.04 2丁香酚甲醚-0.47-- 3菖蒲酮2.691.163.33±0.013.18±0.02 4欖香脂素1.030.631.71±0.021.21±0.02 5β-細(xì)辛醚69.2368.7867.0167.95 6α-細(xì)辛醚6.785.836.876.09 71-異丙基-4,8-二甲基螺[4,5]癸-8-庚-7-單1.290.4231.472.69 8脫羥基異水菖蒲二醇0.320.310.541.29

從表3可以看出,離子液體與水體積比為1∶20時(shí),β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚的相對含量較水為溶劑提取稍微有所下降,但其余成分的相對含量均明顯增高。從GC-MS分析百分比報(bào)告可得,純水提取液中有65.2%(n=3, RSD≤3%)的化合物含量在0.1%以上,而離子液體提取液中,有83.3%(n=3, RSD≤3%)的化合物含量均在0.1%以上。

4 結(jié) 論

采用水蒸汽蒸餾法提取石菖蒲中的揮發(fā)性成分,選用極性特征不同的離子液體作為輔助提取劑。對離子液體的種類,離子液體-水的比例以及離子液體的加入方式進(jìn)行了研究,篩選出離子液體輔助提取的最佳條件。采用GC-MS聯(lián)用儀分析不同提取方法的樣品溶液,結(jié)果表明,離子液體對石菖蒲揮發(fā)油的提取有促進(jìn)作用,研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為未來離子液體在中藥揮發(fā)油方面的應(yīng)用提供重要的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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