陳 思，樊耀華，李 婧，趙 穎，張芝桐，黎子瑩，陳穎慧

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510405)

卵巢產(chǎn)生成熟卵子的數(shù)量減少，或卵泡質(zhì)量下降，均將導(dǎo)致婦女生育能力下降及性激素失調(diào)，稱為卵巢儲備功能下降(diminished ovarian reserve,DOR)，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)量少、閉經(jīng)、排卵障礙、不孕等，同時臨床中以血清基礎(chǔ)卵泡雌激素(bFSH) <40 IU/L，結(jié)合B超及其他血清學(xué)檢查評估輔助診斷DOR；若其進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致卵巢功能衰竭，給患者的生活及工作帶來巨大影響[1-4]。中醫(yī)學(xué)中雖未有DOR的病名記錄，但根據(jù)臨床表現(xiàn)，可歸于月經(jīng)過少、月經(jīng)后期、閉經(jīng)、不孕、年未老水?dāng)嗟炔∽C中?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為腎在DOR的發(fā)病中起到了至關(guān)重要的作用，因此在治療上均提倡以補(bǔ)腎為主。滋腎育胎丸為羅元愷教授之經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血之功，基于“腎主生殖”的原理，抓住其補(bǔ)腎以調(diào)經(jīng)、助孕、安胎的主線，在臨床上也被用于治療DOR[4]，但關(guān)于其治療機(jī)制的研究較少，因此本研究將通過探討滋腎育胎丸對DOR大鼠模型的卵泡、卵泡間質(zhì)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討其治療DOR的機(jī)制，為滋腎育胎丸進(jìn)一步在臨床上推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量175 g左右，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證明編號：44007200027926。對購入動物檢疫3 d，期間每天檢查動物1次，未發(fā)現(xiàn)不健康動物，則全部納入實(shí)驗(yàn)。觀察大鼠動情周期，篩選50只有規(guī)律動情周期的大鼠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥物與試劑 滋腎育胎丸(批號：V0043)，購自廣州白云中一藥業(yè)有限公司；補(bǔ)佳樂(批號：20150415)，購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司；雷公藤多甙片(批號：20150404)，購自遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司；Bcl-2 rabbit polyclonal IgG：Santa Cruz Biotechnology,Inc.Lot No.:G2516；Bax rabbit polyclonal IgG：Santa Cruz Biotechnology,Inc.Lot No.:F3016；羧甲基纖維素鈉(批號：20150119)，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Leica TP1020 脫水機(jī)，Leica EG1140H 包埋機(jī)，Leica RM2255切片機(jī)，Leica Autostainer XL染色機(jī)購自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司)，奧林巴斯IX71倒置顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司。

1.2方法

1.2.1試劑劑量設(shè)計(jì) 雷公藤多甙片劑量為55 mg/kg，每天灌胃1次；滋腎育胎丸低劑量為0.79 g/kg，每天灌胃1次；高劑量為3.15 g/kg，每天灌胃2次；陽性藥補(bǔ)佳樂劑量為0.30 mg/kg，每天灌胃1次。

1.2.2試劑配備 (1)0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液：取4/5總配置量的純凈水至燒杯中，準(zhǔn)確稱量CMC-Na，磁力攪拌器邊加熱邊攪拌下緩慢加入燒杯中，攪拌至完全溶解，放入2～8 ℃冰箱過夜，第2天定容至所需量即可。(2)雷公藤多甙片混懸液：取70片雷公藤多甙片，研磨粉碎后，加4.90 g吐溫80，攪拌均有后，加純凈水至127 mL，攪拌溶解即可。(3)滋腎育胎丸：將滋腎育胎丸研磨后加入0.5%CMC-Na溶液研磨攪拌均勻，使其分別為7.90%(m∶v)及15.75%(m∶v)兩個濃度。(4)補(bǔ)佳樂：將補(bǔ)佳樂加入0.5%CMC-Na溶液研磨攪拌均勻使其濃度為0.03 mg/mL。

1.2.3DOR模型制備 選取動情周期規(guī)律的大鼠40只，其中8只作為對照組，給予0.10 mL/kg的0.5%CMC-Na溶液灌胃，每天1次，連續(xù)14 d。余下的32只大鼠，按0.10 mL/kg體質(zhì)量的劑量灌胃雷公藤多甙片溶液制作DOR模型，每天1次，連續(xù)14 d。自灌胃造模后第4～14天，每天進(jìn)行陰道涂片，觀察動情周期。

1.2.4分組及給藥 將DOR模型制作成功的動情周期紊亂大鼠32只，隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)佳樂組及滋腎育胎丸低、高劑量組(低、高劑量治療組)，每組8只。補(bǔ)佳樂組按0.10 mL/kg體質(zhì)量灌胃補(bǔ)佳樂溶液作為陽性對照；低、高劑量治療組按0.10 mL/kg體質(zhì)量灌胃相應(yīng)濃度的滋腎育胎丸溶液，低劑量治療組1次/天，高劑量治療組2次/天；模型組和對照組給予等量的0.5%CMC-Na溶液，1次/天，連續(xù)35 d。

1.2.5卵巢內(nèi)卵泡計(jì)數(shù) 末次給藥24 h內(nèi)，取大鼠的卵巢組織，進(jìn)行石蠟包埋，切片。病理切片為連續(xù)5 μm切片，每間隔9張取1張切片進(jìn)行HE染色，觀察卵巢組織變化并計(jì)算各類卵泡數(shù)。觀察1個卵巢，卵泡中見卵丘、卵泡腔者稱為大卵泡(竇狀卵泡或成熟卵泡)，卵泡中未見卵丘及明顯卵泡腔者稱為小卵泡(竇前卵泡或始基卵泡)，卵泡的形態(tài)不規(guī)則，卵母細(xì)胞表現(xiàn)為核偏位、固縮、透明帶塌陷，顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞松散、萎縮并脫落入卵泡腔稱為卵泡閉鎖。累積計(jì)算可得大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡的數(shù)量。

1.2.6卵巢Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。經(jīng)抗原修復(fù)(微波法)、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片。置于普通顯微鏡400倍數(shù)下觀察拍片，每個標(biāo)本挑選大、小、閉鎖卵泡及卵巢間質(zhì)各3個區(qū)域進(jìn)行拍片。運(yùn)用Image-Pro Plus 5.1圖像處理系統(tǒng)，對圖片進(jìn)行分析，測定并記錄每張圖片的平均面積、平均光密度值，計(jì)算出累積光密度值(IOD)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠卵巢組織形態(tài)比較 對照組大鼠卵巢皮質(zhì)部有數(shù)個卵泡，處于不同發(fā)育階段，以小卵泡為主；原始卵泡位于皮質(zhì)深層，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠卵巢萎縮，卵泡數(shù)量較少，卵巢皮質(zhì)部有數(shù)個卵泡，處于不同發(fā)育階段，以閉鎖卵泡為主，卵泡顆粒細(xì)胞層次減少，間隙增大；間質(zhì)見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤。高劑量治療組大鼠卵巢較對照組小，卵巢皮質(zhì)部有數(shù)個卵泡，數(shù)量較對照組少，處于不同發(fā)育階段，以小卵泡為主；間質(zhì)見少量炎性細(xì)胞浸潤。低劑量治療組大鼠卵巢較對照組少，卵巢皮質(zhì)部有數(shù)個卵泡，處于不同發(fā)育階段，數(shù)量較對照組少，以小卵泡為主；卵泡顆粒細(xì)胞層次減少，間隙增大；間質(zhì)見少量炎性細(xì)胞浸潤。補(bǔ)佳樂組大鼠卵巢較對照組少，卵巢皮質(zhì)部有數(shù)個卵泡，處于不同發(fā)育階段，以小卵泡為主，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤。各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)，見圖1。

圖1各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)(×100)

2.2各組大鼠卵巢卵泡計(jì)數(shù)比較 與對照組比較，模型組大鼠小卵泡、大卵泡數(shù)量減少，且其閉鎖卵泡數(shù)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高劑量治療組大鼠小卵泡、大卵泡數(shù)量及閉鎖卵泡數(shù)量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低劑量治療組、補(bǔ)佳樂組的小卵泡數(shù)量明顯低于對照組(P<0.05)，大卵泡數(shù)量及閉鎖卵泡數(shù)量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補(bǔ)佳樂組的小卵泡、大卵泡均明顯增加，閉鎖卵泡數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3各組大鼠卵巢Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組大鼠的大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡的Bcl-2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，卵巢間質(zhì)的Bcl-2表達(dá)也略有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，高劑量組治療、低劑量治療組、補(bǔ)佳樂組的大卵泡及小卵泡的Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，閉鎖卵泡和卵巢間質(zhì)的Bcl-2表達(dá)也略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低、高劑量治療組大鼠大卵泡及小卵泡的Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 各組大鼠卵巢卵泡計(jì)數(shù)比較

a：P<0.01,b：P<0.05,與模型組比較；c：P<0.05,與對照組比較

2.4各組大鼠卵巢Bax蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組的大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡中的Bax表達(dá)水平均明顯上升(P<0.05)，卵巢間質(zhì)的Bax表達(dá)水平也略有上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補(bǔ)佳樂組大鼠的大卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡Bax表達(dá)水平有明顯降低(P<0.05)，卵巢間質(zhì)中的Bax表達(dá)水平也略有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 各組大鼠卵巢Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

a：P<0.05，與模型組比較

表3 各組大鼠卵巢Bax蛋白表達(dá)水平比較

a：P<0.05，與模型組比較

3 討 論

流行學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DOR在人群中的發(fā)生率約為10%，一般需要1～6年發(fā)展為卵巢早衰(POF)，嚴(yán)重影響女性的身心健康[1-2]。由于DOR的發(fā)病是多因素綜合作用的結(jié)果，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此臨床上亟須發(fā)現(xiàn)更有效、不良反應(yīng)小的治療方法改善卵巢儲備功能，提高女性的生育能力，調(diào)節(jié)女性的性激素水平。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎在DOR中起到了至關(guān)重要的作用[5-6]。《素問·上古天真論》曰：“女子……二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也?！标U釋了腎藏精氣為化血之源，為婦女的月事、胎孕提供物質(zhì)基礎(chǔ)。因此腎中精氣是否充足，直接影響到婦女經(jīng)血及胎產(chǎn)情況。適孕婦女出現(xiàn)卵巢功能低下等不孕的癥狀，也須從腎之精氣虧虛來考慮。

滋腎育胎丸是全國著名中醫(yī)學(xué)家羅元愷的經(jīng)驗(yàn)方，由廣州白云中一藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)，由黨參、白術(shù)、巴戟天、何首烏、杜仲、續(xù)斷、菟絲子、熟地黃等組成，具有補(bǔ)腎健脾、益氣培元、養(yǎng)血安胎的功能，基于“腎主生殖”的原理，嶺南羅氏婦科流派抓住以補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)、助孕、安胎的主線，在臨床上不僅應(yīng)用自然流產(chǎn)的防治，也用于月經(jīng)不調(diào)、不孕癥、未破裂卵泡黃素化綜合征、卵巢損傷、先兆流產(chǎn)等治療，提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率，以及用于POF和DOR的治療[7-11]。

正常的細(xì)胞凋亡在機(jī)體生長發(fā)育及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用，凋亡過度或不足均會導(dǎo)致不同類型的疾病。Bcl-2是B細(xì)胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因。而Bax則是Bcl-2家族中研究最為廣泛的促凋亡基因，在凋亡過程中起著樞紐作用[6]。女性從胎兒至青春期，卵母細(xì)胞不斷減少，在此過程中，大量卵泡發(fā)生凋亡，以確保最終有適量優(yōu)質(zhì)卵泡維護(hù)卵巢功能[12]，目前發(fā)現(xiàn)尤其是Bcl-2和Bax的表達(dá)對卵泡在生長發(fā)育有重要作用。卵泡在生長發(fā)育過程中的大量丟失與Bax的持續(xù)表達(dá)相關(guān)，而當(dāng)卵泡需要進(jìn)一步增殖時，Bcl-2選擇性表達(dá)，可與Bax互相調(diào)節(jié)，使卵巢儲備維持在合理水平[13-15]。然而，當(dāng)Bcl-2與Bax表達(dá)失調(diào)時，在發(fā)育過程中的卵泡開始凋亡，形成閉鎖卵泡，最終導(dǎo)致DOR[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組的大卵泡、小卵泡計(jì)數(shù)下降，閉鎖卵泡數(shù)量增加，各類卵泡的Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)上升，提示雷公藤多甙可影響卵巢各類卵泡Bcl-2及Bax的表達(dá)，一方面導(dǎo)致小卵泡(竇前卵泡或始基卵泡)不能發(fā)育為大卵泡(竇狀卵泡或成熟卵泡)或誘導(dǎo)小卵泡形成閉鎖卵泡，成熟卵泡數(shù)量下降；另一方面導(dǎo)致大卵泡凋亡加速，成熟卵泡質(zhì)量下降，共同促進(jìn)DOR的發(fā)生與發(fā)展。與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補(bǔ)佳樂組大鼠的大卵泡、小卵泡數(shù)量明顯增加(P<0.05)，閉鎖卵泡數(shù)量明顯減少(P<0.01)，且使大、小卵泡的Bcl-2表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，Bax表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)。提示滋腎育胎丸可通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，下調(diào)Bax表達(dá)水平，從而促進(jìn)DOR模型大鼠的卵巢卵泡發(fā)育生長。但與模型組比較，高劑量治療組、低劑量治療組、補(bǔ)佳樂組的閉鎖卵泡Bcl-2表達(dá)均增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而其Bax表達(dá)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示滋腎育胎丸可能通過調(diào)控Bcl-2家族其他抑制凋亡的基因作用于閉鎖卵泡，需進(jìn)一步研究探討。

在滋腎育胎丸治療中，高劑量治療組大鼠的大卵泡、小卵泡計(jì)數(shù)增加明顯。但在大卵泡、小卵泡的Bcl-2及Bax表達(dá)水平中，高、低劑量無明顯線性關(guān)系，其原因可在日后的研究中進(jìn)一步探究，可能與滋腎育胎丸的有效濃度相關(guān)。在高劑量治療組、低劑量治療組、補(bǔ)佳樂組中，補(bǔ)佳樂組的小卵泡Bcl-2表達(dá)水平最高，Bax表達(dá)水平最低；但在卵泡計(jì)數(shù)方面，高劑量治療組的小卵泡計(jì)數(shù)最高，閉鎖卵泡計(jì)數(shù)最少，這提示滋腎育胎丸除通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax表達(dá)水平外，還可通過其他治療機(jī)制多靶點(diǎn)、高效性地治療DOR，有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，滋腎育胎丸使DOR模型大鼠Bcl-2表達(dá)水平上升，Bax表達(dá)水平下降，抑制卵泡過早、過快地凋亡，促進(jìn)卵巢中的卵泡生長發(fā)育，恢復(fù)卵巢各類卵泡數(shù)量，從而改善卵巢儲備功能，該過程是其治療DOR的機(jī)制之一。因此，滋腎育胎丸是治療DOR具有良好前景的藥物，需深入研究其治療DOR的機(jī)制，有利于其在臨床上進(jìn)一步推廣，為DOR的防治奠定有效的基礎(chǔ)。

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