楊秋香，鄧 實，郭良芳，楊清榮

近年，前列腺癌發(fā)病率已高居我國男性泌尿系統(tǒng)疾病首位，內分泌治療和根治性手術是該惡性腫瘤主要治療方式，但兩種方式皆可因治療后癌灶轉移復發(fā)導致治療失敗，故探索前列腺癌發(fā)病機制，尋找指示前列腺癌預后的標志物十分必要[1-3]。此前，國際上將前列腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)>4 ng/mL作為前列腺癌篩查指標，但臨床應用中發(fā)現(xiàn)，當PSA值處于4～10 ng/mL時，難以區(qū)分前列腺良惡性病變，PSA診斷的特異性、敏感性并不夠理想[4-5]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA)為腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)提供新思路，microRNA為18～26個堿基大小的非編碼單鏈RNA，可對靶基因發(fā)揮調控作用，參與人類癌癥發(fā)生發(fā)展過程[6]。microRNA-21(miR-21)屬于microRNA家族成員之一，目前發(fā)現(xiàn)，其在肺癌、甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌等多種癌組織中表達異?，F(xiàn)象[7]。作者通過特異性TaqMan探針實時定量PCR法探討miR-21在前列腺癌患者癌組織及癌旁組織中的表達情況，并分析其與患者臨床預后的關系，為前列腺癌診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2011年1月—2012年6月四川大學華西醫(yī)院76例行前列腺癌手術切除患者資料。納入標準：①臨床診斷符合世界衛(wèi)生組織有關前列腺癌診斷標準[8]，均行前列腺癌根治性手術治療，每例術中均獲得2份前列腺組織，術后病理檢測確定為1份屬于前列腺癌灶組織，1份屬于癌旁正常前列腺組織；②術前均未接受放化療、內分泌治療等保守方式治療者；③相關病理資料及隨訪資料完整者。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②復發(fā)性前列腺癌者；③術后接受放化療等方式治療者；④合并急性感染、高血壓、糖尿病、肺結核、風濕病等其他疾病者。76例患者均為男性，年齡47～75(58.89±6.74)歲。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 從-80 ℃冰箱取出經病理切片證實為前列腺癌癌組織和癌旁正常前列腺組織的標本2～3 mm3，冷凍勻漿后加入1 mL TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司)，遵照說明書提取總RNA，再使用20 μL焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水(購自美國Ameresco公司)溶解提取總RNA；總RNA提取完畢后，采用NanoVue分光光度計(購自美國GE公司)檢驗獲得RNA樣品純度和質量，吸光度處于1.8～2.0之間為達標樣品，進行后續(xù)反轉錄。

1.2.2 反轉錄獲得cDNA 取一個200 μL去RNA酶微量離心管(Eppendorf，EP)(購自美國Invitrogen公司)，依次加入5 μL RNA(總RNA量最多5 μg)、2 μL microRNA特異性引物(5×)、1 μL 10 mM dNTP Mix、2 μL DEPC水，總量10 μL，標記為Mix1；另取一個50 μL去RNA酶EP管，依次加入2 μL 10×RT反轉錄緩沖液、4 μL 25 mM鎂離子、2 μL 0.1M dTT、1 μL RNaseout 40 u/μL、1 μL SuperScrip RT(200 U/μL)和Mix1，共20 μL反應液，置入聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀(德國Eppendorf公司)，調試程序為16 ℃處理30 min、50 ℃處理30 min、85 ℃處理5 min，反應后獲得cDNA模板，試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2.3 實時定量PCR擴增檢測 miR-21表達量采用特異性TaqMan探針RT-PCR進行檢測，miR-21引物和探針由美國Invitrogen公司設計(引物序列為其專利，不提供具體堿基序列)，U6作為內參基因，miR堿基序列為：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′。準備8 μL超純水、1 μL特異性引物(20×)、10 μL PCR Master Mix、1 μL cDNA模板，總體系20 μL，置于RT-PCT儀。設置如下反應步驟：①95 ℃，120 s；②95 ℃保持10 s退火，60 ℃保持30 s延伸。進行40個循環(huán)，重復實驗3次。儀器軟件獲得CT值，經2-△△CT[9]計算miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達量。

1.3 觀察指標 ①分析miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達情況；②以前列腺癌患者癌灶組織與癌旁正常組織miR-21表達量比值為2作為臨界值[10]，將患者分為miR-21高表達組和低表達組，分析表達量與臨床病理的關系；③采用Kaplan-Meier生存曲線分析miR-21表達量與患者生存的關系。

2 結果

2.1 miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達分析 實時定量PCR分析76份前列腺癌組織和76份癌旁正常前列腺組織miR-21相對表達量發(fā)現(xiàn)，miR-21在前列腺癌組織中相對表達量為(2.68±0.54)，明顯高于癌旁組織的(1.14±0.42)(t=19.62，P<0.05)，圖1，說明miR-21在前列腺癌患者癌組織中具有高表達現(xiàn)象，提示miR-21對前列腺癌具有診斷價值。

圖1 miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達分析

2.2 miR-21與前列腺癌患者病理特征的關系分析前列腺癌患者miR-21高表達者57例(75%)，低表達者19例(25%)。2組TNM分期(χ2=9.444，P=0.002)、Gleason評分(χ2=5.197，P=0.023)、18個月內復發(fā)轉移比較(χ2=10.321，P=0.001)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而年齡(χ2=0.439，P=0.508)、前列腺體積(χ2=0.179，P=0.672)、血清PSA水平比較(χ2=0.441，P=0.506)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表1。

表1 miR-21與前列腺癌患者病理特征的關系分析

2.3 前列腺癌患者miR-21表達量與預后 miR-21表達量低組平均生存期32.5個月，miR-21表達量高組平均生存期24.8個月，經Kaplan-Meier生存分析顯示，2組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.019)，圖2。

圖2 前列腺癌患者組織miR-21表達量與生存的關系分析

3 討論

隨著分子生物學技術的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)microRNA在癌癥發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用，不斷扮演著抑癌基因或原癌基因角色，且不同癌癥microRNA表達譜并不相同[11-12]。miR-21屬于microRNA大家族中的一種，長約18～24 bp，被發(fā)現(xiàn)時間較早，能夠特異性識別并結合mRNA 3′非翻譯區(qū)，發(fā)揮抑制或降解靶mRNA，發(fā)揮轉錄后調控作用，多表達于人體細胞和組織中，參與細胞增殖、分化、凋亡、調控癌癥等過程。目前研究顯示，其在多種癌癥組織中具有過量表達趨勢，如肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌等，但有關前列腺癌相關的研究相對較少[13]。本研究檢測miR-21在前列腺癌患者癌組織中表達情況，并分析其與患者預后的關系，發(fā)現(xiàn)miR-21在前列腺癌患者癌組織中具有高表達現(xiàn)象，且表達情況與前列腺癌患者TNM分期、Gleason評分、復發(fā)轉移和生存期均有關。

研究發(fā)現(xiàn)，大約50%的microRNA定位于癌癥基因組位置，通過調控多種靶基因發(fā)揮抑癌或原癌基因作用，而miR-21主要定位于染色體17q23.2位置，位于常見FRA17B斷裂位點內，此位點被發(fā)現(xiàn)是肺癌、結腸癌、乳腺癌過量擴增位點，且與人類TMEM49基因發(fā)生部分重疊編碼，故miR-21在此位點上調表達，可導致癌癥發(fā)生[14]。本研究miR-21在前列腺癌組織中高表達，證明其在前列腺癌中表達情況與多種癌癥類型過表達一致，miR-21與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展關系密切。張聰?shù)萚15]分析miR-21在前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-21在前列腺癌組織中表達水平高于良性前列腺增生組織，認為miR-21參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，與本研究論點一致。此外，miR-21還參與雄激素非依賴性前列腺癌進展，主要與miR-21能夠在轉錄過程直接調控前列腺癌雄激素受體表達，促進雄激素分泌，進而促進前列腺癌細胞不斷增殖有關[16]。

miR-21不僅可在前列腺癌組織中高表達，而且與前列腺癌手術治療患者預后療效密切相關。miR-21高表達組的TNM分期多為Ⅲ～Ⅳ期，Gleason評分≥7分，18個月內復發(fā)轉移率高，生存期短，且與低表達組差異顯著，說明miR-21表達與前列腺癌進展程度、組織學分級、癌灶復發(fā)轉移和生存期密切相關。腫瘤TNM分期越高，Gleason評分越高，預示腫瘤惡性程度越高，即便給予根治性手術切除，仍有較高復發(fā)轉移風險，降低生存期；而miR-21表達則可指示患者預后，能夠為后期輔助治療方案的制定提供參考，提高治療成功率。目前有關miR-21表達與前列腺癌治療預后的報道并不多，僅張聰?shù)萚15]證實，miR-21與前列腺癌手術治療患者術前Gleason評分相關。抑制腫瘤細胞miR-21表達，其細胞核內AR、AKT、mTOR等蛋白均呈下調表達趨勢，可抑制前列腺癌細胞增殖，故miR-21有望成為前列腺癌新的基因治療靶點。

總之，miR-21在前列腺癌組織中高表達，可能參與該癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，miR-21表達與前列腺癌手術治療患者的TNM分期、Gleason評分、復發(fā)轉移和生存期密切相關，說明其可指示預后療效。但臨床應用組織學標本檢驗miR-21表達情況，受限于樣本取樣，并不適于廣泛推廣，后期還需探究血清miR-21水平在前列腺癌患者中的表達及與預后的關系，及分析miR-21如何影響前列腺癌的生物調節(jié)機制，方可利于抗癌技術發(fā)展，任重而道遠。

【參考文獻】

[1]Chuang KY,Chuang YC,Ho YS.Global influence of cancer statistics articles[J].Curr Sci,2015,109(9):1552-1554.

[2]郭瓊,嚴彬,南小新,等.miRNA-29b在前列腺癌中的表達及意義[J].醫(yī)學臨床研究,2015,32(1):42-44.

[3]張永生,張立平,劉西林,等.快速免疫組化技術在前列腺穿刺組織冰凍切片診斷中的應用[J].中國基層醫(yī)藥,2015,22(11):1700-1703.

[4]Kotb S,Mosharafa A,Essawi M,et al.Circulating miRNAs 21 and 221 as biomarkers for early diagnosis of prostate cancer[J].Tumor Biol,2014,35(12):12613-12617.

[5]Guo YF,Li FH,Xie SW,et al.Value of contrast-enhanced sonographic micro flow imaging for prostate cancer detection with t-PSA level of 4-10 ng/mL[J].Eur J Radiol,2012,81(11):3067-3071.

[6]Garzon R,Fabbri M,Cimmino A,et al.MicroRNA expression and function in cancer[J].Trends Mol Med,2006,12(12):580-587.

[7]Ohno R,Uozaki H,Kikuchi Y,et al.Both cancerous miR-21 and stromal miR-21 in urothelial carcinoma are related to tumour progression[J].Histopathology,2016,69(6):993-999.

[8]《臨床泌尿外科雜志》編輯部.歐洲泌尿學會更新前列腺癌診療指南[J].臨床泌尿外科雜志,2006,21(5):399-400.

[9]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[10]劉風林,王新鋒,王興武,等.非小細胞肺癌組織miRNA-21表達及預后相關性研究[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(18):1397-1399.

[11]單保恩,劉麗華.MicroRNA:癌癥診治新靶點[J].中國腫瘤生物治療雜志,2014,21(6):603-609.

[12]劉田.microRNA在甲狀腺癌中的研究進展[J].蚌埠醫(yī)學院學報,2014,39(3):417-419.

[13]Shibuya H,Iinuma H,Shimada R,et al.Clinicopathological and prognostic value of microRNA-21 and microRNA-155 in colorectal cancer[J].Oncology,2010,79(3/4):313.

[14]Abue M,Yokoyama M,Shibuya R,et al.Circulating miR-483-3p and miR-21 is highly expressed in plasma of pancreatic cancer[J].Int J Oncol,2015,46(2):539-547.

[15]張聰,曹立宇,尹玉,等.前列腺癌組織中miR-21的表達及臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2016,32(12):1365-1367.

[16]Ribas J,Lupold SE.The transcriptional regulation of miR-21,its multiple transcripts and their implication in prostate cancer[J].Cell Cycle,2010,9(5):923-929.