王昶森，楊志偉，劉亞新，張 昂，金 剛，王 飛，張進杰

（1.秦皇島出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，河北秦皇島066004；2.寧夏大學葡萄酒學院，寧夏銀川750021）

多酚化合物是存在于葡萄果皮上的一類重要的次生代謝產(chǎn)物。這類物質(zhì)隨著葡萄果實的破碎、壓榨和發(fā)酵等處理進入葡萄酒中，進而對葡萄酒的品質(zhì)特征產(chǎn)生影響。作為功能性物質(zhì)，花色苷不僅影響葡萄酒的色澤，而且可通過與其他物質(zhì)的結(jié)合，影響葡萄酒質(zhì)量的穩(wěn)定性[1]。

花色苷常以糖苷形式存在，是由花色素與葡萄糖相結(jié)合而生成的糖苷類化合物[2]?；ㄉ盏慕Y(jié)構(gòu)可以分為四大類：基本花色苷、?；ㄉ?、吡喃花色苷、聚合花色苷[3-6]?；净ㄉ罩饕?種形式：飛燕草花色素苷、錦葵花色素苷、芍藥花色素苷、矢車菊花色素苷和矮牽?；ㄉ剀铡；ㄉ兆鳛槠咸丫浦饕噬镔|(zhì)，使其呈現(xiàn)出不同顏色，對葡萄酒的感官品質(zhì)起到?jīng)Q定性作用。葡萄中，花色苷主要存在于紅色、紫色葡萄漿果皮中最靠近表皮3～4層細胞的液泡中[7]。葡萄酒中花色苷的組成特征蘊含了產(chǎn)地、品種、年份以及釀酒工藝等信息，此外，栽培方式、生態(tài)條件、陳釀時間等因素都能不同程度地影響花色苷[8-9]。葡萄酒中花色苷物質(zhì)的組成和含量主要取決于葡萄品種，可作為區(qū)分不同品種紅葡萄酒的化學標志。

除此之外，花色苷還有抗氧化的作用，且針對老年病有著特殊的功效，在預(yù)防老年癡呆，抗糖尿病，保護血管、動脈，抗高血壓，抗炎，抗突變腫瘤、癌癥等方面效果顯著。

因此，分析葡萄及葡萄酒中花色苷尤顯重要。但是在探索過程中發(fā)現(xiàn)錦葵色素產(chǎn)生了兩種同分異構(gòu)體，即錦葵色素3-O半乳糖苷和錦葵色素3-β葡萄糖苷，這兩種物質(zhì)極性相似、性質(zhì)相似，用其他花色苷的區(qū)分方法無法分離。所以建立了新的方法探討這兩種花色苷同分異構(gòu)體的分離。

兩種花色苷同分異構(gòu)體的信息見圖1和圖2。

圖1 錦葵色素3-O半乳糖苷

圖2 錦葵色素3-β葡萄糖苷

本實驗使用的AB Sciex QTRAP?5500 LC/MS/MS系統(tǒng)相比較于其他液質(zhì)儀器其主要特點有：(1)創(chuàng)新的QJet-2離子導(dǎo)入技術(shù)：極大地提高了系統(tǒng)的靈敏度，改善了真空的分配；(2)創(chuàng)新的彎曲LINAC碰撞室：提高了離子傳輸速度，增加了離子容量，同時有效地防止交叉污染，改善了質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量；(3)創(chuàng)新的Q3線性加速技術(shù)：極大地提高了MS/MS掃描能力；(4)獨特的“桿-阱掃描”(MRMIDA-EPI)方式：可以建立高質(zhì)量的EPI質(zhì)譜庫；(5)創(chuàng)新的AcQuRate脈沖離子計數(shù)檢測器：確保系統(tǒng)的重現(xiàn)性和精確性；(6)創(chuàng)新的eQ電子學設(shè)計：確保進行快速掃描和快速正負切換掃描；(7)專利的氣簾氣接口技術(shù)：降低了污染，提高工作效率；(8)Turbo V離子源：這是常規(guī)應(yīng)用的高性能離子源，可適應(yīng)范圍的液相流速要求，有效防止電噴霧的離子抑制現(xiàn)象，具有自清潔探頭的功能；(9)最新版Analyst 1.5軟件提供了最新的定量分析工具包，而且具有智能化的s-MRM數(shù)據(jù)采集模式。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

葡萄酒：長城四星干紅葡萄酒(Great Wall Four-Star Red,Shacheng,China)。

試劑及耗材：三氟乙酸、甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純，F(xiàn)isher(Fairlawn，NJ，USA)公司；錦葵色素3-O半乳糖苷和錦葵色素3-β葡萄糖苷，標準品純度大于 99.5%，Extrasynthese SA(Genay，F(xiàn)rance)公司。

儀器：AB Sciex QTRAP? 5500 LC/MS/MS系統(tǒng)，美國AB公司；去離子水機。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品的稀釋

將標準品拆封后根據(jù)說明書的濃度顯示使用含5%甲酸的甲醇溶液稀釋至1 ppm裝瓶、充氮、密封、冷藏待用。

1.2.2 優(yōu)化質(zhì)譜條件

將配制好的標準品稀釋至1 ppb用移液槍移至進樣瓶，進入質(zhì)譜儀優(yōu)化Q1、Q3、DP、CE、CXP等參數(shù)，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.3 樣品的制備

表1 質(zhì)譜參數(shù)

取部分酒樣，用含5%乙腈的0.1%三氟乙酸稀釋500倍，渦旋混合后用移液槍轉(zhuǎn)移1 mL至進樣瓶。

1.2.4 進樣準備

第一次進樣：分別將兩種標準品稀釋至1 ppb，分別進樣，隨后兩種標準品混合至1 mL進樣。

第二次進樣：將兩種標準品等量與酒樣混合至1 mL進樣。

1.2.5 色譜條件

ODS色譜柱(C18柱)，美國安捷倫公司(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B：乙腈。洗脫程序：0～0.5 min，0%～5%B；0.5～0.6 min，5%～15%B；0.6～2.5 min，15%B；2.5～2.6 min，15%～18%B；2.6～5 min，18%B；5～5.5 min，18%～5%B；5.5～8 min，5%～0%B。

柱溫：30℃；檢測波長：525 nm；波長掃描范圍：200～900 nm；進樣量：30 μL。質(zhì)譜采用電霧噴離子源(ESI)，正離子模式，離子掃描范圍：100～1000 m/z；噴化器壓力：35 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：350℃。每個樣品重復(fù)進樣2次。梯度洗脫程序見圖3。

圖3 梯度洗脫

2 結(jié)果與分析

圖4 錦葵色素3-O半乳糖苷和錦葵色素3-β葡萄糖苷出峰圖

錦葵色素3-O半乳糖苷和錦葵色素3-β葡萄糖苷出峰圖見圖4。由圖4可看出，使用這種方法和梯度洗脫可以將兩種同分異構(gòu)體分離，與第一次進樣的圖對比可知，混標中1號峰為錦葵色素3-O半乳糖苷，2號峰為錦葵色素3-β葡萄糖苷，所以第二次進樣即可分辨兩種花色苷，此方法可應(yīng)用于鑒別葡萄酒中是否含這兩種花色苷，并區(qū)分。

在建立方法后，使用該方法對一批酒樣進行了檢測，驗證了方法的普遍性。結(jié)果見表2。

經(jīng)檢驗可知，葡萄酒中的錦葵色素3-O半乳糖苷含量較高且在整體花色苷中所占比例也較大，而作為其同分異構(gòu)體的錦葵色素3-β葡萄糖苷含量較少。所以兩種物質(zhì)可以主要考慮錦葵色素3-O半乳糖苷。

3 結(jié)論

本方法的優(yōu)勢在于：

(1)利用UPLC-MS/MS的方法對葡萄酒兩種花色苷進行了分離,試驗方法有很好的重復(fù)性,分離效果好,兩種花色苷的峰圖有較好的峰型以及分離度。該方法可以作為兩種同分異構(gòu)體的區(qū)分方法。

(2)對兩種葡萄酒花色苷進行了分析,并建立了參考模型。參考模型從圖形和數(shù)據(jù)上反映出不同花色苷的差別,兩種花色苷可以通過特征峰的響應(yīng)值和保留時間區(qū)別。

(3)與前人的研究方法對花色苷的研究方法比較,本研究使用了更為先進的UPLC-MS/MS方法,完整地比較出峰的特征,不需要對葡萄酒中的物質(zhì)進行鑒定和定量測定,大大簡化了分析操作。

(4)初步建立兩種葡萄酒花色苷UPLC出峰圖譜數(shù)據(jù)庫,對同分異構(gòu)體花色苷進行了很好的區(qū)分。繼續(xù)對此數(shù)據(jù)庫的完善,可以更有效地鑒別更多性質(zhì)相似的花色苷。

表2 錦葵色素3-O半乳糖苷及錦葵色素3-β葡萄糖苷含量

但是該方法只能測定酒樣里有無花色苷及其含量，無法鑒定花色苷在酒中起的影響和性質(zhì)，所以該實驗方法尚需改進。

[1]DE FREITAS V,MATEUS N.Formation of pyranoanthocyanins in red wines:a new and diverse class of anthocyanin derivatives[J].Analytical and bioanalytical chemistry,2011,401(5)：1463-1473.

[2]王麗娜.寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄品質(zhì)與葡萄酒質(zhì)量的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學,2011.

[3]HAN F L,JIANG S M,HE J J,et al.The anthocyanins in Cabernet Gernischet(Vitis viniferaL.cv.)aged red wine and their color in aqueous solution analyzed by partial least square regression[J].Food sci biotechnol,2009,28(3)：724-731.

[4]MONAGAS M,MARTIN-ALVAREZ P J,BARTOLOME B,et al.Statistical interpretation of the color parameters of red wines in function of their phenolic composition during aging in bottle[J].Eur food res tech,2005,222(4)：702-709.

[5]RENTZSCH M,SCHWARZ M,WINTERHALTER P.Pyranoanthocyanins:an overview on structures,occurrence,and pathways of formation[J].Trend food sci technol,2007,18(5)：526-534.

[6]IBERN-GOMEZ M,ANDRES-LACUEVA C,LAMUELA-RAVENTOS R M,et al.Rapid HPLC analysis of phenolic compounds in red wines[J].Am j enol viticult,2001,53(3)：218-221.

[7]劉麗媛,苑偉,劉延琳.紅葡萄酒中花色苷輔助成色作用的研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2010,43(12)：2518-2526.

[8]JIANG B,ZHANG Z W.Comparison on phenolic compounds and antioxidant properties of Cabernet Sauvignon and Merlot wines from four wine grape growing region in China[J].Molecules,2012,17(8)：8804-8821.

[9]JESSICA M C,JAMES A K.Effect of shading on accumulation of flavonoid compounds in(Vitis viniferaL.)Pinot Noir fruit and extraction in a model system[J].Journal of agricultural and food chemistry,2006,54(11)：8510-8520.