呂開績，陳旭東，程開，王路得，朱進順，Kamara Saidu，張麗芳，朱冠保

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）及其配體（programmed death ligand-1，PD-L1）是屬于B7家族的協(xié)同刺激分子。PD-1是I型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、疏水性跨膜區(qū)、細胞質(zhì)區(qū)組成，CD4+T細胞、CD8+T細胞、NKT細胞、B細胞和單核細胞等在激活后都能表達PD-1分子[1]。PD-L1也屬I型跨膜蛋白，同樣具有胞外區(qū)、疏水性跨膜區(qū)、細胞質(zhì)區(qū)，PDL-1可在IFN-γ誘導(dǎo)作用下廣泛表達于許多腫瘤細胞表面，研究表明，在黑色素瘤、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤中呈現(xiàn)過表達[2]。當(dāng)PD-1與PD-L1結(jié)合后，會啟動T細胞的抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯著抑制T細胞活化和增殖，導(dǎo)致細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的凋亡，使得機體的免疫監(jiān)控?zé)o法識別腫瘤細胞，從而可逃避宿主免疫，最終導(dǎo)致腫瘤的進一步發(fā)展[3-4]。阻斷該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后可以恢復(fù)T細胞的功能，因此PD-1/PD-L1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路正成為腫瘤治療研究的熱門靶點。本研究采用原核表達系統(tǒng)制備了小鼠PD-1胞外區(qū)（mPD-1）及其配體PD-L1胞外區(qū)（mPD-L1）蛋白，并且用mPD-L1蛋白免疫日本大耳兔從而獲得多克隆抗體，并分別應(yīng)用ELISA和免疫熒光的方法，驗證了原核表達的mPD-L1和mPD-1之間的結(jié)合親和性，以及原核表達的mPD-1和天然mPD-L1之間的結(jié)合親和性，為PD-L1過表達的腫瘤的靶向診斷及治療研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 pET21a（+）、pGEX 4T-1克隆載體和E.coliBL21（DE3）為本實驗室保存。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NedI、XhoI、EcoRI購自美國Thermo公司；異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）購自美國默克公司；氨芐青霉素購自濟南齊魯藥廠；弗式佐劑購自美國Sigma公司；小鼠抗His mAb、小鼠抗GST mAb購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）抗體和山羊抗鼠IgG（H+L）抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）和羊抗鼠IgG（H+L）購自上海聯(lián)科生物技術(shù)公司；鎳螯合親和層析膠（Ni-NTA Agarose）購自德國Qiagen公司；B16細胞株由本實驗室保存；胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；健康日本大耳白兔（雌性，體質(zhì)量2.0～2.5 kg），來自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 方法

1.2.1 pET21a（+）/mPD-L1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及mPDL1蛋白原核表達、純化和鑒定：全基因合成mPD-L1基因序列，經(jīng)過原核密碼子優(yōu)化后在其上下游引入限制性內(nèi)切酶NedI、XhoI酶切位點，克隆至pET21a（+）載體，構(gòu)建pET21a/mPD-L1重組質(zhì)粒。將測序正確的重組質(zhì)粒pET21a（+）/mPD-L1轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細菌后，接種至15mL LB培養(yǎng)基中（含100μg/mL氨芐青霉素），37℃，震蕩培養(yǎng)過夜。再從以上菌液中取10μL加至500mL LB培養(yǎng)基中（含100μg/mL氨芐青霉素），37℃，震蕩培養(yǎng)3h。之后經(jīng)終濃度為1.0mmol/L IPTG 37℃ 誘導(dǎo)6h后收菌，12 000r/min離心5min。經(jīng)PBS洗滌、離心、超聲破菌，12 000r/min離心5min收集上清，進行SDS-PAGE和Western blot分析，以His-tag鼠單抗為一抗，用HRP標(biāo)簽的羊抗鼠IgG作為二抗；進一步收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達的菌液，1 200r/min，5min離心取沉淀，加入8mol/L尿素使其溶解，經(jīng)超聲破菌處理、離心后棄沉淀，取上清，上清中的蛋白經(jīng)過Ni-NTA Agarose柱純化、洗脫，將收集到的蛋白依次在4、2mol/L尿素中透析2h，最后在PBS緩沖液中透析過夜。

1.2.2 制備mPD-L1兔多克隆抗體、測定抗體的效價并鑒定其特異性：用純化后的mPD-L1蛋白免疫健康的日本大耳白兔，同時設(shè)計陰性對照組。1、3、5周對兔子進行隔周免疫。首次免疫方案：將完全弗氏佐劑與500μg mPD-L1蛋白在冰上等量混合充分乳化，之后二次免疫，將不完全弗氏佐劑與500μg mPD-L1等量混合，其余操作如前。每次對每只日本大耳白兔進行背部皮內(nèi)多點注射。同時，于0、2、4、6周于兔耳緣靜脈取血，將收集的血液于37℃水浴內(nèi)放置1h，之后3 000r/min，4℃離心，25min，分離血清并分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。ELISA檢測：用包被液緩沖液（0.05mol/L碳酸緩沖液，pH 9.6）稀釋純化的mPD-L1蛋白以10μg/mL的濃度加入酶標(biāo)板孔中，設(shè)2個復(fù)孔，4℃過夜；5%脫脂奶粉按1:80稀釋0、2、4、6周血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二 抗；驗證免疫血清中mPD-L1蛋白特異IgG抗體效價持續(xù)上升后，于第6周從兔心臟取血，收集血清方法如上。第6周血清抗體效價用間接ELISA法檢測，將mPD-L1蛋白以10μg/mL的濃度包被96孔板，4℃過夜，第2天分別將第6周免疫兔血清進行倍比稀釋，初始的稀釋度為1:50，之后以5倍的稀釋比倍比稀釋，直至稀釋比為1:781 250，稀釋后的血清為一抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。將96孔板置于酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值，所有血清標(biāo)本均設(shè)置2個復(fù)孔檢測，同時將PBS與弗式佐劑免疫后混合乳化，免疫得到的血清作為陰性對照。將mPD-L1蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，將多克隆兔血清（以1:5 000稀釋）作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）作為二抗，檢測兔血清中mPD-L1蛋白特異IgG抗體對mPD-L1蛋白的特異性識別和結(jié)合能力。

1.2.3 pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒構(gòu)建及mPD-1蛋白原核表達純化和鑒定：全基因合成mPD-1基因序列，經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后在其上下游引入限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoRI酶切位點，克隆至pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒。將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/mPD-1轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細菌后中，挑單克隆接種于15mL LB液體培養(yǎng)基中（含100μg/mL氨芐青霉素），37℃，振蕩培養(yǎng)過夜。次日取10mL菌液加至500mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3h，誘導(dǎo)方法如前。離心收集菌體，先用PBS洗滌1次，然后用適量尿素重懸沉淀，超聲波裂解，12 000r/min，離心5min，取上清和用尿素溶解后的沉淀分別進行SDS-PAGE分析，結(jié)果提示上清中含有大量mPD-1蛋白。收集上清，用GST純化柱進行純化，用pH 7.3的平衡緩沖液過柱，然后將獲得的上清上樣，結(jié)束后繼續(xù)加入平衡緩沖液，隨后經(jīng)pH 8.0洗脫緩沖液（含50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L還原型谷胱甘肽）將融合蛋白洗脫下來并收集。將GST-tag單抗為用作一抗，然后用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）為二抗，進行Western blot分析和鑒定。

1.2.4 ELISA檢測mPD-1和mPD-L1的親和性：用包被液緩沖液稀釋mPD-L1蛋白至終濃度為10μg/mL，以每孔100μL的量包被ELISA板，4℃過夜。次日用PBS洗滌3次后用5%脫脂牛奶37℃封閉1h；PBST（含0.5mL/L Tween 20）洗滌3次后，用同濃度脫脂牛奶稀釋mPD-1蛋白，以10μg/mL（100μL）加至包被的孔上37℃反應(yīng)1.5h，PBS-T洗滌4次，加入抗GST小鼠單克隆抗體（1:5 000），37℃反應(yīng)1.5h 后，PBS-T洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:10 000），37℃反應(yīng)1h，PBS-T洗滌4次，將TMB顯色液以每孔100μL的量加至96孔板，37℃避光顯色10min，加50μL終止液（2mol/Lh2SO4）終止反應(yīng)。本研究中利用mPD-1攜帶GST標(biāo)簽?zāi)芘cGST-鼠單抗特異性結(jié)合作為檢測指標(biāo)，分別以未加mPD-1蛋白、mPD-L1蛋白、抗GST單克隆抗體作為3個陰性對照，反應(yīng)結(jié)果置酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光度值，利用Graphpad6.0軟件繪制相應(yīng)圖表。

1.2.5 免疫熒光體外驗證mPD-1對天然PD-L1的親和性：以常規(guī)方法復(fù)蘇傳代以B16細胞（小鼠黑色素瘤細胞）。將B16細胞以10 000/孔的量鋪在48孔板上，同時加以100 ng/mL的IFN-γ以誘導(dǎo)PD-L1的表達，設(shè)置陰性對照，將48孔板放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。實驗組和對照組同時添加200μg/mL 過濾后的mPD-1蛋白，孵育6h；用PBS洗滌，經(jīng)4%多 聚甲醛固定15min；0.3% Triton-X100，處理15min。 20%胎牛血清（培養(yǎng)基）封閉1h，37℃。用PBS洗滌后，加一抗（GST-鼠抗1:2 000）37℃ 1h；洗滌后FITC抗鼠37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入的PI 30μL染核5min，之后加入20μL RNA酶抑制劑PBS-T洗3次，避光，載玻片上滴熒光粹滅劑，細胞面朝下放在載玻片共聚焦顯微鏡下觀察，并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pET21a（+）/mPD-L1重組質(zhì)粒構(gòu)建及mPD-L1蛋白原核表達、鑒定、純化 mPD-L1全長663個堿基，經(jīng)密碼子堿基優(yōu)化后全基因序列合成，并經(jīng)NedI、XhoI酶切位點作用后克隆至克隆載體pET21a（+）內(nèi)，構(gòu)建pET21a（+）/mPD-L1重組質(zhì)粒，之后將重組質(zhì)粒送至測序，見圖1，經(jīng)測序鑒定正確。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組質(zhì)粒E.coliBL21（DE3）中表達，一條明顯蛋白條帶出現(xiàn)在相對分子質(zhì)量為25 kDa的位置，與預(yù)期蛋白大小相一致。同時將純化后的mPDL1蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量25 kDa的位置處同樣出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小相一致的單一的蛋白條帶。Western blot檢測結(jié)果顯示，在25 kDa處出現(xiàn)同樣單一反應(yīng)帶，見圖2。

圖1 重組質(zhì)粒pET21a（+）/mPD-L1構(gòu)建和鑒定圖

2.2 mPD-L1兔多克隆抗體效價測定及特異性鑒定 將純化后的PD-L1蛋白作為包被抗原檢測兔0、2、4及6周血清mPD-L1特異性IgG抗體的效價，mPD-L1蛋白免疫組兔血清于免疫后第2周開始，多克隆抗體效價逐漸升高，至第6周達高峰。ELISA檢測結(jié)果顯示，第6周mPD-L1蛋白免疫組兔多克隆抗體IgG的效價可達1:156 250。多克隆抗體經(jīng)Western blot鑒定后在25 kDa處出現(xiàn)單一條帶，見圖3。

2.3 pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒構(gòu)建及mPD-1蛋白原核表達、鑒定和純化 mPD-1蛋白全長447個堿基，經(jīng)原核密碼子堿基優(yōu)化后送至公司全基因合成，并經(jīng)EcorI、XhoI酶切位點克隆至pGEX-4T-1載體，構(gòu)建pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確，見圖4。重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，收菌后得到的菌液用PBS溶解，之后超聲裂解后取上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后在相對分子質(zhì)量約40 kDa的位置得到一條明顯蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大小相符。同時將純化后的mPD-1蛋白經(jīng)上述電泳方法進行分析，結(jié)果顯示純化后的蛋白與預(yù)期蛋白大小相符。經(jīng)Western blot檢測，在40 kDa處出現(xiàn)單一反應(yīng)帶，見圖5。2.4 ELISA法檢測mPD-1/mPD-L1結(jié)合活性 實驗組（PD-L1+PD-1+GST）與對照組（PD-L1+GST、PD-1+GST、PD-L1+PD-1）的OD450值分別為0.907±0.038、0.016±0.001、0.063±0.009、0.018±0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明mPD-1蛋白與mPD-L1蛋白在體外能夠特異性結(jié)合，具有良好的親和性。2.5 體外免疫熒光的親和性驗證 在經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)后的B16細胞膜可見強綠色的點狀或團塊狀綠色熒光斑點，而未經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)的細胞株未見明顯的綠色熒光斑點，見圖6。

圖2 mPD-L1蛋白的SDS-PAGE及Western blot圖

圖3 兔多克隆抗體的效價測定以及特異性鑒定

3 討論

PD-L1和PD-1特異性結(jié)合后會負性調(diào)控在活化T細胞表面的PD-L1所介導(dǎo)的信號通路，從而使T細胞的活化和增殖受到顯著抑制，并且導(dǎo)致某些細胞因子表達和分泌失常，如IFN-γ、IL-2。已有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1調(diào)控的免疫耐受能夠?qū)е履[瘤細胞逃避免疫監(jiān)視以及某些病毒的慢性感染及其他多種相關(guān)的自身免疫性疾病[5-8]。PD-L1能夠在IFN-γ誘導(dǎo)后高效地表達在腫瘤細胞表面，進一步加劇PD-1/PD-L1通路的抑制性調(diào)控信號，導(dǎo)致機體出現(xiàn)異常低下的免疫功能，T細胞部分甚至全部喪失功能，淋巴細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答受到抑制，從而導(dǎo)致腫瘤細胞逃避CTL的殺傷和清除[9]。研究表明，利用PD-1或PDL1的抗體特異性阻斷PD-1/PD-L1信號通路途徑，可恢復(fù)T細胞活性，并抑制腫瘤的生長[11]，因此，阻斷PDL-1/PD-1介導(dǎo)的負性調(diào)控機制已成為臨床上腫瘤免疫療法或抗病毒感染治療的新策略，干擾PD-1/PD-L1信號途徑已成為目前治療PD-L1表達腫瘤的新方法[11-13]。目前，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)PD-1/PD-L1單克隆抗體上市用于治療PD-L1高表達的腫瘤，如：Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab。

本研究采用原核表達系統(tǒng)，高效表達并且純化mPD-L1和mPD-1蛋白，發(fā)現(xiàn)mPD-1蛋白存在于上清中，因此利用GST純化柱將其純化，而mPD-L1蛋白則存在于包涵體內(nèi)，因此用變性緩沖液將其變性，之后再用尿素梯度透析將其復(fù)性并且用Western blot將獲得的蛋白進行驗證。利用mPD-L1免疫日本大耳白兔制備了mPD-L1的多克隆抗體，并且通過ELISA測定該抗體的效價，通過Western blot鑒定該抗體的特異性，結(jié)果顯示多克隆抗體在1:156 250稀釋時仍然有較高的效價，并且能夠特異性識別mPD-L1蛋 白，后期可以將該抗體用于組織水平驗證PD-L1的表達。該多克隆抗體與本實驗室制備的其他抗體一 樣，均有較高的效價以及良好的特異性[14]。進一步采用ELISA，通過與對照組的對比，發(fā)現(xiàn)mPD-L1蛋 白與mPD-1蛋白在體外能夠結(jié)合，應(yīng)用免疫熒光驗證了mPD-1能夠與細胞表面天然存在的PD-L1蛋白結(jié)合。

綜上所述，經(jīng)原核細胞表達并純化后獲得的mPD-L1和mPD-1蛋白之間具有良好的親和性，同時本研究在細胞水平驗證了mPD-1蛋白與細胞表面的天然PD-L1之間也具有特異性結(jié)合的親和性。mPD-1能否阻斷在體PD-1/PD-L1通路達到腫瘤的治療作用尚待后續(xù)進一步研究。通過同源性匹配分析發(fā)現(xiàn)人源性PD-L1全長蛋白和鼠源性PD-L1全長蛋白同源性達到69%，其胞外區(qū)蛋白的同源性達到了73%。因此，本研究獲得的mPD-1原核蛋白也可為人源PD-L1陽性腫瘤的診斷和治療方面的研究提供實驗基礎(chǔ)。

圖4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/mPD-1構(gòu)建和鑒定圖

圖5 mPD-1蛋白的SDS-PAGE以及Western blot圖

圖6 mPD-L1兔多克隆抗體間接免疫熒光檢測（×400）

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