林武，黃昭帥，鮑苗，陳肖鳴

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

得益于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）的多向分化潛能，其為終末期肝臟疾病提供了可觀的潛在細(xì)胞移植供體。和體外培養(yǎng)的人原代肝細(xì)胞相比，誘導(dǎo)而來的“肝細(xì)胞樣細(xì)胞”的表型相對(duì)不成熟[1-6]，表現(xiàn)出與人體胚胎肝更相近的功能及表型特征[7]。然而即使是這樣不成熟的肝細(xì)胞卻也能很大程度地改善肝功能[8-9]。另外，在細(xì)胞移植中約只有10%的移植細(xì)胞存活[10-11]。近年來，ESC分泌因子的細(xì)胞保護(hù)作用逐漸被人們揭示，我們假設(shè)ESC移植治療肝臟損傷疾病的成功不僅是細(xì)胞移植本身的組織替代作用，其分泌的細(xì)胞因子也能夠幫助肝細(xì)胞抵抗凋亡，修復(fù)肝損傷。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM/F12、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、 2-巰基乙醇、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、 0.25%胰酶EDTA購于美國Gibco公司；核酸混合物、白細(xì)胞抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）購于美國Millipore公司；胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒混合物（insulin-transferrin-selenium，ITS）、雙抗（100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）購于美國Invitrogen公司；地塞米松、MTT試劑盒購于美國Sigma公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；缺氧裝置購于加拿大Stemcell Technologies公司；Seahorse線粒體應(yīng)激檢測(cè)試劑盒購于美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：ESC（F12）細(xì)胞系由美國羅格斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Melitta Schachner教授贈(zèng)予；完全培養(yǎng)基為15% FBS、1%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、1%核酸混合物、0.2% 2-巰基乙醇、1%雙抗、0.01% LIF；基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM（含L-谷氨酰胺），培養(yǎng)ESC時(shí)需要每天加入0.01% LIF以維持ESC的未分化狀態(tài)。解凍ESC，接種到用絲裂霉素處理的鋪滿成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，在傳過3～4代之后，成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞基本去除干凈，ESC懸浮培養(yǎng)于其完全培養(yǎng)基中。本課題中以其完全培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基即CON-M；ESC每2～3 d傳1代，并收集上清液，此ESC上清液即為條件培養(yǎng)基即ESC-M。細(xì)胞于含5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。AML-12細(xì)胞系為一種鼠源性肝細(xì)胞系，從美國ATCC公司購入；AML-12細(xì)胞完全培養(yǎng)基（簡(jiǎn)寫為CM）為10% FBS、1% ITS、40 ng/mL地塞米松、1%雙抗、88% DMEM/F12。

1.2.2 AML-12細(xì)胞的培養(yǎng)方法：常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)：AML-12細(xì)胞培養(yǎng)于CM中，并置于含5% CO2、21% O2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中；缺氧環(huán)境培養(yǎng)：AML-12分別培養(yǎng)于CON-M和ESC-M中，并置于5% CO2、1% O2、 37℃的缺氧裝置中；室內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)：AML-12分別培養(yǎng)于CON-M和ESC-M中，并直接置于室內(nèi)非細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中（極低CO2濃度、21% O2、20℃）；無血清培養(yǎng)：分別用CON-M和ESC-M處理AML-12細(xì)胞48h后，胰酶消化并按照每孔6 000個(gè)細(xì)胞數(shù)目的濃度重懸2種不同處理的細(xì)胞在CM中并接種于96孔板中，待細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜貼壁后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成去除血清的CM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 MTT細(xì)胞活性測(cè)定：取接種于96孔板中的AML-12細(xì)胞，棄舊液，每孔加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的CM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3h，棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO搖床搖晃溶解10min后，立即在酶標(biāo)儀中測(cè)定570 nm處的OD值。每組做3次重復(fù)，并做3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Seahorse細(xì)胞代謝呼吸動(dòng)態(tài)分析：根據(jù)Agilent的Seahorse線粒體應(yīng)激檢測(cè)試劑盒說明書來操作，步驟如下：分別用CON-M和ESC-M培養(yǎng)AML-12細(xì)胞48h后，胰酶消化并按照每孔種6 000個(gè)細(xì)胞數(shù)目的濃度重懸2種不同處理的細(xì)胞在CM培養(yǎng)基中并接種于Seahorse XFp細(xì)胞板中，待細(xì)胞在培養(yǎng)箱中過夜貼壁后，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成Seahorse XFp基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并在37℃烘箱中作用1h，之后將培養(yǎng)板的蓋子換成事先在不同通道中加入相應(yīng)呼吸鏈抑制劑的特殊蓋子并加載入Seahorse分析儀中，分析儀自動(dòng)加藥并測(cè)量細(xì)胞的耗氧量以及細(xì)胞外酸化率。每組做3次重復(fù)，并做3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行2組比較，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常培養(yǎng)環(huán)境下AML-12細(xì)胞在3種培養(yǎng)基中的細(xì)胞活性比較 分別用ESC-M、CON-M和CM培養(yǎng)AML-12細(xì)胞，并置于含5% CO2、21% O2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，MTT法比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性情況。結(jié)果顯示在正常培養(yǎng)環(huán)境下，AML-12細(xì)胞在3種培養(yǎng)基中細(xì)胞活性及生長情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 AML-12細(xì)胞在3種培養(yǎng)基中的細(xì)胞活性比較

2.2 極端培養(yǎng)環(huán)境中AML-12細(xì)胞在2種培養(yǎng)基中的細(xì)胞活性比較 分別用CON-M和ESC-M培養(yǎng)AML-12細(xì)胞，并分別置于缺氧環(huán)境和室內(nèi)非細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境（極低CO2濃度、20℃）中，MTT法比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性情況。結(jié)果顯示在缺氧環(huán)境中，AML-12細(xì)胞生長緩慢且在ESC-M中培養(yǎng)的AML-12細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的增殖能力（見圖2A-C）。在室內(nèi)非細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中，AML-12細(xì)胞逐漸凋亡且在ESC-M中培養(yǎng)的AML-12細(xì)胞顯示出更持久的耐受能力（見圖2D-F）。

圖2 AML-12細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)性比較

2.3 被ESC上清液處理之后AML-12細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)基的耐受性 分別用CON-M和ESC-M處理AML-12細(xì)胞48h后，MTT法比較不同處理組AML-12細(xì)胞在其無血清完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長情況，結(jié)果顯示細(xì)胞逐漸凋亡且被ESC-M處理后的AML-12細(xì)胞表出現(xiàn)出更強(qiáng)的無血清培養(yǎng)耐受能力，見圖3。

圖3 被不同培養(yǎng)基處理之后AML-12細(xì)胞對(duì)無血清環(huán)境的耐受能力比較

2.4 被胚胎干細(xì)胞上清液處理之后AML-12細(xì)胞的糖酵解潛力和氧化呼吸潛力 Seahorse細(xì)胞代謝呼吸動(dòng)態(tài)分析顯示，被CON-M和ESC-M處理之后的AML-12細(xì)胞，其基礎(chǔ)呼吸情況以及糖酵解情況類似。當(dāng)用ATP合酶抑制劑寡霉素抑制氧化呼吸鏈ATP合成后，ESC-M組的AML-12細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞糖酵解潛力；以解偶聯(lián)劑FCCP干預(yù)后，ESC-M組的AML-12細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化呼吸能力及氧化呼吸潛力，見圖4。

3 討論

圖4 被不同培養(yǎng)基處理之后AML-12細(xì)胞代謝呼吸情況比較

研究表明對(duì)急性肝損傷小鼠進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植能夠減輕肝臟結(jié)構(gòu)紊亂和肝細(xì)胞功能的下降程度，并且能夠促進(jìn)肝臟的再生[12-13]。陳棉等[14]研究發(fā)現(xiàn)在體外缺氧條件下MSCs凋亡膜微?？纱龠M(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成能力。陳志文等[15]研究發(fā)現(xiàn)MSCs移植增強(qiáng)了子宮切口的再生愈合，提高了切口局部的機(jī)械張力，有望降低再次妊娠時(shí)子宮破裂的風(fēng)險(xiǎn)。MSCs對(duì)急性肝損傷的治療作用的具體機(jī)制目前并不明確，其分泌的細(xì)胞因子可能是發(fā)揮作用的關(guān)鍵，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)MSCs的上清液能夠改善肝臟損傷情況[16-18]。WOO等[19]單純給急性肝損傷小鼠注射由ESC分化而來的不成熟“肝細(xì)胞樣細(xì)胞”細(xì)胞分泌因子，發(fā)現(xiàn)在不進(jìn)行細(xì)胞移植的情況下，肝臟也出現(xiàn)明顯的再生和修復(fù)，并且證明了細(xì)胞移植治療的成功不單單是移植的細(xì)胞取代了組織，還可能是由于移植細(xì)胞的分泌因子促進(jìn)了組織的再生。MORIYA等[20]將未分化的ESC移植在已經(jīng)用四氯化碳引起的肝纖維化的小鼠脾中，發(fā)現(xiàn)移植了ESC之后，小鼠肝臟的纖維化情況明顯好轉(zhuǎn)。這些研究都顯示出ESC的分泌因子在肝臟疾病治療中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究以鼠源性肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12細(xì)胞來研究ESC上清液（即ESC-M培養(yǎng)基）對(duì)肝細(xì)胞在極端環(huán)境中抗凋亡能力的影響，研究發(fā)現(xiàn)ESC-M能夠增強(qiáng)AML-12細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的適應(yīng)性，增強(qiáng)其在血清剝奪以及室內(nèi)非細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的耐受能力。同時(shí)用Seahorse細(xì)胞代謝分析儀對(duì)分別經(jīng)過CON-M和ESCM處理后的AML-12細(xì)胞呼吸代謝情況進(jìn)行分析，當(dāng)用ATP合酶抑制劑寡霉素抑制氧化呼吸鏈ATP合成之后，細(xì)胞所需能量全部由糖酵解提供，而糖酵解的產(chǎn)能效率低下，為滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求，糖酵解加快發(fā)生，此時(shí)以細(xì)胞外酸化率間接反應(yīng)的細(xì)胞糖酵解能力為細(xì)胞最大糖酵解能力，結(jié)果顯示ESCM處理組的AML-12細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞糖酵解潛力。解偶聯(lián)劑FCCP使得質(zhì)子大量回流但不產(chǎn)生ATP，從而使得細(xì)胞大量耗氧，此時(shí)以細(xì)胞氧消耗率反應(yīng)的細(xì)胞氧化呼吸能力為細(xì)胞最大氧化呼吸能力，同樣顯示ESC-M處理組的AML-12細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞最大氧化呼吸能力以及氧化呼吸潛力。這與我們之前發(fā)現(xiàn)ESC-M中的AML-12細(xì)胞在缺氧、血清剝奪以及其他惡劣環(huán)境下具有更強(qiáng)適應(yīng)性相吻合。

LOTFINIA等[12]研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在MSC上清液對(duì)急性肝損傷中肝細(xì)胞的修復(fù)具有重要作用，而WANG等[21]發(fā)現(xiàn)ESC-M與CON-M相比，VEGF含量顯著上升，這提示ESC-M中的VEGF或許是增強(qiáng)AML-12細(xì)胞抗凋亡能力的關(guān)鍵。然而SINGLA等[22]研究卻發(fā)現(xiàn)ESC-M中TIMP1是抑制H9c2細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。

本研究發(fā)現(xiàn)ESC上清液能夠增強(qiáng)AML-12細(xì)胞在極端環(huán)境中的抗凋亡能力。后續(xù)對(duì)其具體分泌因子的研究和機(jī)制的挖掘或許能夠給肝臟疾病以及其他與細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的治療提供新的思路，也可能對(duì)細(xì)胞的保存和運(yùn)輸提供借鑒意義。

[1] SULLIVAN G J, HAY D C, PARK I H, et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells[J]. Hepatology, 2010, 51(1): 329-335.

[2] SI-TAYEB K, NOTO F K, NAGAOKA M, et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells[J]. Hepatology, 2010, 51(1):297-305.

[3] BASMA H, SOTO-GUTIERREZ A, YANNAM G R, et al.Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes[J]. Gastroenterology, 2009,136(3): 990-999.

[4] hAY D C, FLETCHER J, PAYNE C, et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(34): 12301-12306.

[5] AGARWAL S, HOLTON K L, LANZA R. Efficient differ-entiation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells[J]. Stem Cells, 2008, 26(5): 1117-1127.

[6] CAI J, ZHAO Y, LIU Y, et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells[J].Hepatology, 2007, 45(5): 1229-1239.

[7] BAXTER M, WITHEY S, HARRISON S, et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocytelike cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes[J].J Hepatol, 2015, 62(3): 581-589.

[8] hE Z Y, DENG L, LI Y F, et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatocytes correct metabolic liver disease after serial liver repopulation[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012,44(4): 648-658.

[9] BASMA H, SOTO-GUTIERREZ A, YANNAM G R, et al.Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes[J]. Gastroenterology, 2009,136(3): 990-999.

[10] SCHIERLE G S, HANSSON O, LEIST M, et al. Caspase inhibition reduces apoptosis and increases survival of nigral transplants[J]. Nat Med, 1999, 5(1): 97-100.

[11] EMGARD M, HALLIN U, KARLSSON J, et al. Both apoptosis and necrosis occur early after intracerebral grafting of ventral mesencephalic tissue: a role for protease activation[J]. J Neurochem, 2003, 86(5): 1223-1232.

[12] LOTFINIA M, KADIVAR M, PIRYAEI A, et al. Effect of secreted molecules of human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells on acute hepatic failure model[J].Stem Cells Dev, 2016, 25(24): 1898-1908.

[13] LIU Z, MENG F, LI C, et al. Human umbilical cord mesenchymal stromal cells rescue mice from acetaminophen-induced acute liver failure[J]. Cytotherapy, 2014, 16(9): 1207-1219.

[14] 陳棉, 王玨, 耿志敏, 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件膜微粒對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的影響[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 46(9): 625-628.

[15] 陳志文, 楊孝軍, 張乾, 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植增強(qiáng)大鼠子宮切口再生修復(fù)[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 44(8):561-564.

[16] PAREKKADAN B, VAN POLL D, SUGANUMA K, et al.Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure[J]. PLoS One, 2007, 2(9): e941.

[17] VAN POLL D, PAREKKADAN B, CHO C H, et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo[J].Hepatology, 2008, 47(5): 1634-1643.

[18] CHRIST B, BRUCKNER S, WINKLER S. The therapeutic promise of mesenchymal stem cells for liver restoration [J].Trends Mol Med, 2015, 21(11): 673-686.

[19] WOO D H, KIM S K, LIM H J, et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice[J]. Gastroenterology,2012, 142(3): 602-611.

[20] MORIYA K, YOSHIKAWA M, OUJI Y, et al. Embryonic stem cells reduce liver fibrosis in CCl4-treated mice[J]. Int J Exp Pathol, 2008, 89(6): 401-409.

[21] WANG X, CHEN T, LENG L, et al. MIF produced by bone marrow-derived macrophages contributes to teratoma progression after embryonic stem cell transplantation[J]. Cancer Res, 2012, 72(11): 2867-2878.

[22] SINGLA D K, MCDONALD D E. Factors released from embryonic stem cells inhibit apoptosis of H9c2 cells[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 293(3): H1590-1595.