劉 剛,寧 宇,夏曉飛,龔明昊,*

1 中國林業(yè)科學(xué)研究院濕地研究所,北京 100091 2 濕地生態(tài)功能與恢復(fù)北京市重點實驗室,北京 100091 3 北京自然博物館,北京 100050

食性研究是動物生態(tài)學(xué)的重要內(nèi)容之一,是了解動物與環(huán)境關(guān)系及捕食者與獵物關(guān)系的前提,同時也是構(gòu)建棲息地選擇和利用模型、探討取食對策和營養(yǎng)流動、評估物種生存狀況和生態(tài)系統(tǒng)功能等熱點問題的基礎(chǔ)[1- 4]。食性分析方法的準(zhǔn)確性和精確性直接關(guān)系到食性相關(guān)理論的探索,同時也關(guān)乎食性結(jié)果應(yīng)用于動物保護(hù)的實踐。研究者對食性相關(guān)問題的研究越來越深入,食性分析方法也在不斷改進(jìn)和更新。傳統(tǒng)食性方法,大多基于形態(tài)學(xué)鑒定、光譜結(jié)構(gòu)差異或同位素原理,解決了很多與食性相關(guān)的生態(tài)學(xué)問題,但由于受到技術(shù)和適用范圍的限制,這些方法還存在一些不足(表1)。

表1 各種食性分析方法的分析依據(jù)、優(yōu)劣及適用范圍的比較

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,該技術(shù)逐漸擴(kuò)展到野生動物的食性分析,相關(guān)研究也在增多。高通量測序技術(shù)由于具有靈敏度高和數(shù)據(jù)通量大的特點,能在一個測序平臺產(chǎn)生上百萬條reads,其高效性特別受到研究者的青睞 (表 1)。另外,對于PCR來說,短片段的效率要高于長片段,而食性分析樣品(糞便、食團(tuán)或胃容物等),都存在不同程度的降解,較適宜短片段擴(kuò)增,這意味著,高通量測序的讀長范圍非常適合食性分析 (表 1);高通量測序以其高靈敏性,能捕獲頻次較低的DNA序列,表明少見取食的食物DNA也能被檢測到;高通量測序產(chǎn)生的DNA序列,通過與數(shù)據(jù)庫比對,可將食物的分類精確到種級別分類單元,準(zhǔn)確性高 (表 1);基于DNA序列數(shù),還可判斷動物對食物取食的相對量和偏好。盡管高通量測序的優(yōu)勢較為明顯,但由于涉及到的步驟較多,受到的影響因素較為復(fù)雜,目前高通量測序應(yīng)用于食性分析還屬于研究比較薄弱的領(lǐng)域。本文就高通量測序技術(shù)應(yīng)用于野生動物食性分析進(jìn)行方法概述,總結(jié)相關(guān)研究動態(tài),評述存在的問題,并展望應(yīng)用前景。

1 糞便DNA和高通量測序用于食性分析的流程

基于高通量測序分析動物食性的基本流程是：提取食性樣品中食物殘渣的DNA→選擇兼?zhèn)涓咄ㄓ眯院透叻直媛实腄NA條形碼引物→PCR擴(kuò)增(引物可加相應(yīng)的寡核苷酸標(biāo)簽)→高通量擴(kuò)增子測序→獲得DNA序列→生物信息學(xué)分析(序列篩選、比對、判定)→判斷食性樣品中各個DNA序列所對應(yīng)的食物種類[17]。

1.1 樣品采集、保存和DNA提取

目前高通量測序用于食性分析的研究中,絕大多數(shù)以糞便作為樣品,有少數(shù)幾項分析嚙齒動物和蝗蟲食性的研究采用胃內(nèi)容物[18-19],還有一些研究鳥類食性的,除了用糞便外,還采用食團(tuán)[20]。糞便是特別適宜于研究野生動物尤其是珍稀瀕危動物的非損傷性樣品,通過不同的提取方法,可從糞便中提取出目標(biāo)動物DNA、食物DNA、微生物DNA、寄生蟲DNA[21]。糞便的新鮮程度是決定糞便DNA質(zhì)量的關(guān)鍵,直接影響DNA提取、PCR和測序的效果。糞便DNA的質(zhì)量還與糞便的采集部位有關(guān),取糞便(糞球、糞團(tuán)或糞粒)的中心、中層和外皮進(jìn)行混合,能顯著提高檢出率,尤其是攝食量較少的食物。在取樣數(shù)量方面,Erickson等[22]對同一份糞便樣品,取樣3次分別進(jìn)行高通量測序,發(fā)現(xiàn)樣品內(nèi)差異顯著小于樣品間差異,表明沒有必要對同一份糞便樣品重復(fù)取樣。

糞便保存方法和DNA提取方法,以及二者的交互作用,決定著所采集糞便中食物殘渣DNA的質(zhì)量。保存方法和提取方法對分子標(biāo)記用于保護(hù)遺傳學(xué)研究的影響已有很多[23],但對食性分析的影響,目前還未見到相關(guān)研究。在食性分析中,常用的糞便保存方法有硅膠干燥法(嚙齒類[24]; 棕熊[25])、緩沖液保存法(蜥蜴[26])、乙醇法(蝙蝠[27])、冷凍法(蝙蝠[28]; 蜥蜴[26]; 海豹[29]; 大鴇[30])等,也有采用兩步保存法的,如乙醇和冷凍保存 (蝙蝠[31]),乙醇和硅膠保存(豹貓[32])。研究者還需綜合考慮保存方法在野外的可行性,以及運輸?shù)谋憷浴?/p>

糞便DNA提取方法大多采用較為常用的商業(yè)化糞便DNA提取試劑盒,文獻(xiàn)中以QIAamp DNA Stool Mini Kit最為常見,但也有例外[33]。研究表明,QIAamp DNA Stool Mini Kit中的inhibitex含有馬鈴薯吸附劑,可能會在DNA提取時混入,導(dǎo)致馬鈴薯出現(xiàn)在本不取食馬鈴薯的動物的食譜中,因此,在分析植食性動物的食性時盡可能避免使用這種試劑盒[34]。MoBio, Epicentre, 和 Qiagen 的糞便DNA提取試劑盒,在小嘴烏鴉(Corvuscorone)食性分析上效果均不如CTAB提取法[35]。在提取西藍(lán)鴝(Sialiamexicana)的糞便DNA用作高通量測序時,QIAamp DNA Stool Mini Kit的提取效率顯著低于Zymo Soil/Fecal DNA MiniPrep Kit[36]。在選擇糞便DNA提取方法時,文獻(xiàn)中食性相近的物種可作為參考,但還需研究者摸索出適宜的方法。

1.2 PCR擴(kuò)增和高通量測序

動物食性一般可分為動物性食物、植物性食物和雜食性。從食性分析樣品中提取的DNA

一般存在一定程度的降解,長度過長的DNA條形碼在PCR擴(kuò)增時效果欠佳,長度過短PCR效果好但分辨率又會下降。因此,高通量測序技術(shù)應(yīng)用于食性分析,需要結(jié)合DNA條形碼的特性和動物總體食性特征,不同的食性特征要求選擇不同的DNA條形碼或宏條形碼(metabarcoding) (表2)。

高通量測序應(yīng)用于食性分析,其最大的優(yōu)勢是可將多個PCR產(chǎn)物混合起來,在一個測序反應(yīng)中得到巨量數(shù)據(jù)。通過對引物兩端加上相應(yīng)的寡核苷酸標(biāo)簽,待測序結(jié)束后,在數(shù)據(jù)分析過程中可根據(jù)標(biāo)簽對應(yīng)到個體。寡核苷酸多聚體的堿基數(shù)取決于混樣個體數(shù),樣品越多,多聚體堿基數(shù)越多,但過多會影響PCR效率。一般采用八聚體,且八聚體間差異應(yīng)大于5,即可滿足要求[39]。將PCR產(chǎn)物等量混合,構(gòu)建擴(kuò)增子文庫,進(jìn)行高通量測序。如何篩選高通量測序得到序列,直接關(guān)乎后續(xù)數(shù)據(jù)的處理。在此,主要考慮PCR和高通量測序產(chǎn)生的冗余序列,可通過相應(yīng)的程序予以篩選和剔除[26, 32]。

表2 高通量測序用于動物食性分析中常用的DNA條形碼類型和序列

1.3 構(gòu)建本地潛在食源DNA條形碼數(shù)據(jù)庫

通過高通量測序平臺產(chǎn)生的序列需要與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,才能判斷DNA序列對應(yīng)的食物種屬[40]。由于動物和植物的地理分布存在很大差異,公共數(shù)據(jù)庫 (NCBI,EMBL,DDBJ) 僅收錄了研究者上傳的局部范圍內(nèi)的部分DNA條形碼,還遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足食性分析研究者的需求[17]。另外,DNA條形碼的種類繁多,分辨率也存在差異。根據(jù)動物的食性,需選擇不同的DNA條形碼或DNA條形碼組合,但公共數(shù)據(jù)庫如果缺乏這種DNA條形碼數(shù)據(jù),將會降低食性分析的分類精度,進(jìn)而影響食性結(jié)果用于瀕危動物保護(hù)生物學(xué)實踐。這就要求,研究者需根據(jù)研究目的構(gòu)建基于所選DNA條形碼的全部本地潛在食源DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。

構(gòu)建本地DNA條形碼的步驟：(1) 根據(jù)目標(biāo)動物的活動區(qū)域覓食區(qū)域,采集潛在食源的組織材料,輔以分類學(xué)家的形態(tài)學(xué)鑒定,從物種水平確定食源種屬; (2) 對采集的食源組織材料,提取DNA,基于食性分析時所選擇的DNA條形碼,合成相應(yīng)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;(3) 通過Sanger測序,構(gòu)建本地潛在食源DNA條形碼數(shù)據(jù)庫,供后續(xù)高通量測序得出的DNA序列進(jìn)行比對。通過構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫或者增加DNA條形碼的種類,能在一定程度上提升分辨率[34],以分析植食性動物為例,構(gòu)建rbcL庫可使序列鑒定到種水平的比例達(dá)72%[22]。而未構(gòu)建地方數(shù)據(jù)庫,鑒定到種的比例顯著降低,如在比對蝙蝠食性的高通量數(shù)據(jù)時,僅有4%—20%的序列能夠鑒定到種或?qū)偎絒37]。更為重要的是,本地DNA條形碼庫本身就可直接用于生物多樣性的評估和監(jiān)測[41]。

1.4 高通量測序數(shù)據(jù)分析

在與建立的本地數(shù)據(jù)庫和公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對時,通過序列相似性判斷序列的物種歸屬,但閾值的設(shè)定目前仍然存在爭議。一部分研究者采用寬松的相似性閾值來判定種分類階元,如采用97%[18, 31],或采用更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拈撝?如采用99%[37, 42]和100%[26],也有的建議根據(jù)不同的DNA條形碼和研究目的,采用不同的閾值[25]。對于一些未構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫的研究,在后續(xù)分類歸屬階段,雖然可以采取聚類方法,通過分子可操作單位 (MOTU,Molecular operational taxonomic units)完成食物組成的差異分析,但總體來說,構(gòu)建地方數(shù)據(jù)庫將有助于提高序列的分類歸屬,明確物種具體取食哪種食物,也能推動食性研究結(jié)果應(yīng)用于物種的保護(hù)實踐[17]。

2 食性分析的應(yīng)用進(jìn)展

2.1 食物組成分析

食性研究中,首先需要確定動物的食物組成。通過高通量測序,食物被鑒定出的種類和比例是形態(tài)學(xué)鑒定無法相比的。Egeter等[43]利用高通量測序技術(shù)對褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)和普通刺猬(Erinaceuseuropaeus) 攝食蛙的種類進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)與形態(tài)學(xué)顯微分析相比,高通量測序技術(shù)將胃內(nèi)容物中蛙的檢測率從2%提升到70%,將糞便中蛙的檢測率從0提升到53%。江允中等[44]分析了褐河烏 (CincluspallasiiTemminck)的食性,發(fā)現(xiàn)食物組成涵蓋6目8科11屬,其中以家蠅科黑蠅屬(Ophyra)占優(yōu)勢,但由于沒有構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫,近50%的序列無法鑒定。Brown等[33]研究了奧地利滑蛇(Coronellaaustriaca),首次發(fā)現(xiàn)一些小型哺乳動物也是蛇的主要食物。Leray等[45]利用高通量測序分析了3種魚的食物組成,檢測到292個可操作分類單元 (Operational taxanomic units, OTUs),其中51%可鑒定到種水平,另外26%可鑒定到屬水平。高通量測序甚至還用于無脊椎動物的食性,Hamb?ck等[46]通過高通量測序技術(shù)鑒定了542只狼蛛胃內(nèi)容物的DNA組成,發(fā)現(xiàn)了223個OTUs,其中99個可鑒定到種水平。

2.2 食物對種內(nèi)和種間關(guān)系的影響

食物是動物生存和繁殖所需能量和營養(yǎng)的來源,食物關(guān)系則反映了物種間的基本關(guān)系。

食性存在物種差異,同域分布的物種為了避免競爭,可能會進(jìn)化出不同的覓食對策,如選擇不同的微生境、取食不同的食物或者在不同的時間覓食,以滿足能量和營養(yǎng)需求[47]。食物因子在物種共存和物種競爭中發(fā)揮著重要作用[48],而研究食性是探明食物選擇機(jī)制的前提。對于同一物種,由于雌雄個體承擔(dān)的繁殖任務(wù)不同可能表現(xiàn)出性別差異,甚至由于個性因素而表現(xiàn)出食性的個體差異[49]。Lopes等[24]通過高通量測序分析和比較了兩種櫛鼠的食物組成,發(fā)現(xiàn)二者食性相差顯著,但由于未進(jìn)行季節(jié)性比較,不排除在高能量需求條件下,如繁殖季節(jié),二者存在食物重疊或部分重疊的可能。Soininen等[50]比較了分布于北極的兩種旅鼠的冬季食性,結(jié)合高通量數(shù)據(jù)和食物資源調(diào)查數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)兩種旅鼠食物組成高度重疊,但是該地區(qū)豐富的食物能夠滿足需求,因此種間競爭并不明顯。

食性研究為研究行蹤隱秘的物種與資源之間的關(guān)系提供了新的手段,有助于揭示物種共存和食物重疊的機(jī)制。來自蝙蝠的高通量測序食性研究表明,同域分布的兩種形態(tài)相近的近緣食蟲蝙蝠,在主要食物上表現(xiàn)出高度重疊,但在各自的專性食物上卻相互分開,證實了食物資源分配是物種共存的機(jī)制[51]。Burgar等[37]隨后利用高通量測序又分析了另外3種食蟲蝙蝠的食性,發(fā)現(xiàn)蝙蝠間形態(tài)學(xué)差異越大,在資源利用方面表現(xiàn)出更顯著的異質(zhì)性,而且這種異質(zhì)性與生長發(fā)育階段和性別有關(guān)。

2.3 食性與行為關(guān)系

動物是否遷徙、何時遷徙以及遷徙到何處,除受遺傳因素控制外,環(huán)境因子如食物也起到了重要作用[52]。遷徙過程對能量需求非常高,動物通過生理、行為和食性變化以適應(yīng)環(huán)境的改變。糞便組織顯微鑒定發(fā)現(xiàn)納氏伏翼(Pipistrellusnathusii)在秋季遷徙期和夏季居留期食性相似度較高,但分辨率更高的高通量測序結(jié)果則顯示這兩個時期的食性差異較大,夏季以森林昆蟲為主,而秋季則以濕地昆蟲為主,納氏伏翼采取了不同的覓食策略以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐氖澄镔Y源變化[42]。鳥類遷徙前夕,通常會高效地補(bǔ)充能量和營養(yǎng)物質(zhì),Bounas 和 Sotiropoulos[53]關(guān)于黃爪隼(Falconaumanni)的研究證實了這種覓食策略,即黃爪隼通過食譜變窄、頻繁覓食和攝取能量更高的直翅目動物來為遷徙做準(zhǔn)備。

隨著高通量測序技術(shù)運用于食性研究,食性分析的精度得以提高,食性定量分析的準(zhǔn)確性顯著上升,也對一些通過行為學(xué)觀察或形態(tài)學(xué)鑒定手段建立的食性理論提出了挑戰(zhàn)。最佳覓食理論認(rèn)為,專食性動物在遇到食物資源減少的情況時,會轉(zhuǎn)向進(jìn)食一些之前不喜選擇的食物,轉(zhuǎn)變?yōu)榉菏承晕锓N[31]。但是,對水鼠耳蝠(Myotisdaubentonii)的食性分析發(fā)現(xiàn),即使在冬眠前能量需求大、食物可獲得性變小的條件下,也未表現(xiàn)出食譜拓寬的跡象,表明水鼠耳蝠對食物的選擇偏好不受時空限制[31]。具有性二型特征的物種,一般在食物資源利用上表現(xiàn)出性別差異,Kartzinel 和 Pringle[26]利用高通量測序技術(shù)分析了沙氏變色蜥(Anolissagrei)的食性,發(fā)現(xiàn)雌性個體的食物多樣性高于雄性。

2.4 捕食者-獵物-環(huán)境關(guān)系

棲息地為動物提供了所需的食物資源,獨特的生態(tài)環(huán)境可能進(jìn)化出了特異的食物選擇行為,同時棲息地的變化也會導(dǎo)致食物可獲得性和食物多樣性的變化。食性與棲息地關(guān)系的研究為了解動物的覓食策略和棲息地選擇提供了依據(jù),高通量測序技術(shù)能在較大的空間尺度上高效地分析不同棲息地動物的食性。Clare等[28]利用高通量測序分析了不同棲息地棕色鼠耳蝠 (Myotislucifugus) 的食性,結(jié)果表明：受污染較輕棲息地內(nèi)的蝙蝠食物較豐富,提出了蝙蝠的食物質(zhì)量可作為評價環(huán)境質(zhì)量的一個指標(biāo)。Trevelline等[54]對路易斯安那水鶇 (Parkesiamotacilla) 通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行食性分析,發(fā)現(xiàn)水鶇食物中陸生昆蟲占比很大,改變了之前認(rèn)為水鶇偏好污染水生環(huán)境中的昆蟲的觀點。

捕食者、獵物和環(huán)境間的關(guān)系和相互作用,一直以來是生態(tài)學(xué)家關(guān)注的方向。食草動物可能與自然植物群落的形成和分布關(guān)系密切,甚至對外來入侵植物也有影響。Erickson等[22]通過高通量測序技術(shù)分析了白尾鹿(Odocoileusvirginianus)對本地植物和外來入侵植物的取食偏好,發(fā)現(xiàn)白尾鹿選擇本地植物作為主要食物,并在一定程度上促進(jìn)了外來入侵植物的擴(kuò)張。Khanam等[19]分析了3種嚙齒動物的食性,掌握了它們覓食植物和無脊椎動物的種類,為鼠害的生物防控提供了科學(xué)依據(jù)。

3 高通量測序用于食性分析的影響因素和展望

3.1 PCR影響

在食性相關(guān)的實驗研究和理論研究中,高通量測序技術(shù)應(yīng)用越來越普遍,但也存在一些不容忽視的局限性和不確定性[17, 40]。高通量測序技術(shù)應(yīng)用于食性分析主要是基于擴(kuò)增子測序,模板 DNA的質(zhì)量、PCR和高通量測序技術(shù)本身均會單獨或交互影響最終結(jié)果。無論是以糞便還是以胃內(nèi)容物和食團(tuán)作為樣品,從中提取的DNA均存在不同程度的降解,并含有PCR抑制劑,均對PCR擴(kuò)增效率和正確率產(chǎn)生不利影響[55]。另外,為了節(jié)約成本,在引物上加上區(qū)分個體的標(biāo)簽,也會造成PCR錯配的發(fā)生[56]。PCR階段的誤差,傳遞到高通量測序過程,還會被放大,進(jìn)一步影響最終結(jié)果。樣品DNA中不同DNA片段,如果PCR效率相差2%,則導(dǎo)致在35個循環(huán)后PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)相差30%[17]。

鑒于高通量測序具有能夠在一個測序反應(yīng)中實現(xiàn)同時測定不同類型食物DNA的特點,即將動物和植物的DNA條形碼置于復(fù)合PCR中構(gòu)成宏DNA條形碼,極大提高了測序效率,降低了測序成本。比如,De Barba等[25]開發(fā)了一種基于宏DNA條形碼的非損傷性食性分析方法,對棕熊(Ursusarctos)的食性進(jìn)行全面分析,定量分析了棕熊食譜中脊椎動物、無脊椎動物和植物所占的比例。但是,動物和植物DNA條形碼的引物在PCR時,其擴(kuò)增效率是不一致的,擴(kuò)增效率高的很可能抑制擴(kuò)增效率低的,導(dǎo)致PCR受到抑制的食物被低估。因此,在高通量測序應(yīng)用于雜食動物進(jìn)行復(fù)合PCR時,很有必要設(shè)置陽性對照和重復(fù)。

3.2 污染影響

污染是高通量測序應(yīng)用于食性分析一個不可忽視的誤差來源。在采樣、樣品處理和PCR環(huán)節(jié),如果存在污染,會在測序過程被靈敏度非常高的高通量測序平臺捕獲,導(dǎo)致食物多樣性被高估或影響食性差異分析結(jié)果,比如,在分析埃及獴(Herpestesichneumon)食物的高通量數(shù)據(jù)時,就發(fā)現(xiàn)樣品間存在交叉感染[57]。還有一個污染來源屬于生態(tài)型,即動物在覓食食物后,被更高級別的捕食者取食,在分析更高級別捕食者食性時,就不可避免引入污染,這在食性分析中也是需要特別注意的問題[17],但目前還沒有相關(guān)研究評估這種二次污染的影響[26]。因此,在分析復(fù)雜食物鏈結(jié)構(gòu)中的物種時,需特別注意二次污染的影響[58]。另外,在分析食肉動物的食性時,使用的DNA條形碼很可能同時將目標(biāo)動物的相應(yīng)片段擴(kuò)增出來,對后續(xù)高通量測序形成干擾和占用測序資源[59],通過設(shè)計blocking oligo可阻斷引物與捕食者的模板DNA結(jié)合[25]。

3.3 定量分析

相對于食物種類和食物多樣性,動物攝取某種食物所占比例以及對食物的偏好選擇,是研究者更為關(guān)注的問題。基于高通量測序得出食物DNA的序列數(shù),是否定量反映了食物被攝取的量和比例,目前仍然存在爭議[56]。高通量測序產(chǎn)生的DNA序列數(shù)較多的食物,有可能被偶爾攝食,而序列數(shù)少的卻有可能是主要食物或喜好食物[17]。造成這種偏差的原因包括生物因素和技術(shù)因素,生物因素：同種食物中不同細(xì)胞的DNA拷貝數(shù)存在差異、食物不同組織所含細(xì)胞數(shù)不同、動物對每種食物的消化率等;技術(shù)因素：對不同食物DNA模板的PCR擴(kuò)增效率差異、引物標(biāo)簽引入的誤差、PCR擴(kuò)增可能發(fā)生錯配、測序方向、冗余數(shù)據(jù)剔除參數(shù)設(shè)置等。這些因素對食性數(shù)據(jù)的定量化,帶來較大困擾。比如,通過企鵝被喂食4種魚的控制實驗發(fā)現(xiàn),高通量測序數(shù)據(jù)與平行進(jìn)行的定量PCR所得數(shù)據(jù)一致,表明高通量測序的序列數(shù)可定量反映攝食量,即DNA序列數(shù)高的食物,被攝食越多[60]。然而,有關(guān)港海豹(Phocavitulina)的研究表明,喂食魚的比例與高通量測序得出的序列數(shù)比例并不相符[56]。

既然基于擴(kuò)增子測序的食性分析還存在不足,怎樣才能讓高通量測序技術(shù)數(shù)據(jù)在定性和定量上可靠而又可信呢？在同一個研究中,除了進(jìn)行高通量測序外,平行開展另一種食性分析方法是驗證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的有效途徑。Srivathsan等[38]采用全基因組shotgun方法定量分析了白臀葉猴(Pygathrixnemaeus)的食性,該方法不需要PCR,發(fā)現(xiàn)全基因組法比擴(kuò)增子測序得出了更高的食物多樣性,但通過比較分析,也驗證了擴(kuò)增子測序法在相對定量上是可信的。值得注意的是,有關(guān)白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的研究卻發(fā)現(xiàn)全基因組法得出的食物多樣性明顯偏低,大部分序列為微生物,相反擴(kuò)增子測序法準(zhǔn)確性更高[22]。

采用高通量測序技術(shù)分析食性,其數(shù)據(jù)量和將食物鑒定到種水平的特點,是其他食性分析方法所不具備的。由于該技術(shù)應(yīng)用于食性分析才剛剛興起,一些技術(shù)細(xì)節(jié)和影響因素仍需注意。隨著高通量測序技術(shù)逐漸成熟和穩(wěn)定，以及研究者對誤差因素的重視和控制,該技術(shù)將得到更廣泛和更深入的應(yīng)用。目前,世界上絕大多數(shù)動物的食性,現(xiàn)在還處于較為粗略的定性描述階段,隨著高通量測序技術(shù)成本降低,期待更多的動物學(xué)家利用該技術(shù)分析食性,整合食性結(jié)果去解釋一些更加復(fù)雜但又富有意義的問題,比如,探討動物對植物的采食與植物授粉和種子擴(kuò)散生態(tài)過程的關(guān)系,確定哪些植物的授粉過程需要哪種動物的介導(dǎo),定位動物在食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)中扮演的生態(tài)角色[61];研究氣候變化對動物食性偏好和轉(zhuǎn)變的影響,預(yù)測動物喜食食物受氣候變化的影響,模擬動物如何通過轉(zhuǎn)變食性以適應(yīng)全球變暖[62];高通量測序技術(shù)與其他技術(shù)手段聯(lián)合,將為食性分析的應(yīng)用開啟更廣闊的空間。高通量測序在確定食物種類和差異上獨具優(yōu)勢,而穩(wěn)定同位素能夠分析食物的來源和能量流動,兩種方法相輔相成,對復(fù)雜食物網(wǎng)的研究具有重要應(yīng)用前景[46]。隨著高通量測序技術(shù)在定量分析食性方面日漸成熟,有助于聯(lián)合營養(yǎng)幾何學(xué)深入探討動物的營養(yǎng)需求和覓食策略[63]。

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