敖清瑩，曾智勇，徐 國(guó)，楊 霞，何祥艷，何小莉，張愛瓊，咸 文，葉百川

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以發(fā)熱、奇癢(豬除外)、腦脊髓炎為主要特征的一種急性傳染病[1]。偽狂犬病毒能感染多種宿主，其中豬是該病毒的主要宿主，各年齡段的豬均可感染，新生仔豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，還可出現(xiàn)腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀；成年豬通常為隱性感染，主要引起妊娠母豬死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率、流產(chǎn)及種豬不育[2]。我國(guó)20世紀(jì)40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)了偽狂犬病毒，60年代初在豬群中也出現(xiàn)了該病毒的流行。至今偽狂犬病毒仍在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的安全[3]。PRV屬于皰疹病毒(Herpesuiri-dae)、α-皰疹病毒亞科，基因組為線狀雙股DNA，長(zhǎng)約150 kb，編碼70～100種蛋白質(zhì)，其基因組中G+C含量最高達(dá)73%[4]。PRV的毒力由多種基因共同控制，主要有編碼胸苷激酶(TK)、糖蛋白gI、gD、gE和核苷酸還原酶(RR)等基因[5-6]，其中g(shù)E基因是該病毒復(fù)制非必需的糖蛋白[7]。此外gE基因還是PRV的病毒復(fù)制和主要毒力決定基因的非必需獨(dú)立基因，是一種能夠促進(jìn)細(xì)胞融合的糖蛋白，該特性能介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散[8-9]，研究表明去除糖蛋白gE可導(dǎo)致PRV毒力減弱[10]，所以目前市面上流通的偽狂犬疫苗大部分為gE基因缺失疫苗。自2011年開始，全國(guó)各地已免疫豬偽狂犬病病毒疫苗免疫的豬場(chǎng)開始頻繁發(fā)生豬偽狂犬病，對(duì)我國(guó)豬群及養(yǎng)豬行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。行宇等[11]于2012～2014年對(duì)河南省豬場(chǎng)進(jìn)行g(shù)E抗體的調(diào)查，結(jié)果表明3年來(lái)gE陽(yáng)性率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。李峰等[12]于2012～2013年對(duì)濱州及周邊地區(qū)開展豬病毒性疾病的流行現(xiàn)狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)2012年和2013年P(guān)RV野毒的檢出率與2011年相比顯著升高。自2012年后，我國(guó)多個(gè)省市報(bào)道PRV新流行株的分離與鑒定，但是貴州省PRV病毒分離的報(bào)道相對(duì)較少。本研究對(duì)2017年所分離的一株P(guān)RVgE基因進(jìn)行TA克隆后測(cè)序，并進(jìn)行序列分析，以期為豬偽狂犬病的防控以及開發(fā)新型豬偽狂犬病疫苗提供科學(xué)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraciton Kit Ver.5.0核酸提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、LA Taq聚合酶、DNA DL2 000 Marker等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit (100) 膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；普通質(zhì)量微量提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 毒株

病毒液為實(shí)驗(yàn)室早先將某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)疑似感染PRV的豬腦組織、淋巴結(jié)及臟器混合樣本經(jīng)處理后接種Vero細(xì)胞，經(jīng)病毒鑒定所獲得的PRV GZJS2017毒株。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[11]的引物序列并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 PRV gE基因的PCR擴(kuò)增

用核酸提取試劑盒提取將接種Vero細(xì)胞的3代病毒液的核酸作為模板，進(jìn)行PRVgE基因的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為25.0 μL：核酸模板4.25 μL，dNTP 4.0 μL，2×GC Buffer Ⅱ12.5 μL，LA Taq酶0.25 μL，上、下游引物各2.0 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 sec；63℃退火45 sec；72℃延伸2 min；35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 gE基因的克隆與序列分析

將目的基因經(jīng)凝膠回收純化后克隆至pMD19-T載體，重組陽(yáng)性質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。利用生物學(xué)分析軟件DNAStar、MEGA6.0軟件對(duì)測(cè)序所得序列并分別與GenBank上登錄的其他PRV毒株的gE基因序列(表1)進(jìn)行比對(duì)、分析。

表1 本研究中所收集的國(guó)內(nèi)外PRV毒株的gE基因Tab.1 The gE genes of domestic and foreign PRV strains

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV GZ-JS2017株gE基因的PCR擴(kuò)增及其TA克隆

提取病毒液核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳凝膠檢測(cè)見有1700 bp左右的目的條帶，結(jié)果與預(yù)期相符(圖1)。

M：DNA DL 2 000Marker 1：PRVgE基因PCR擴(kuò)增

圖1 PRVgE基因的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果
Fig.1 PCR product ofgEgene of PRV

將PCR產(chǎn)物純化回收后TA克隆至pMD19-T載體，經(jīng)過(guò)氨芐抗性和雙酶切等鑒定后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上的相關(guān)RRVgE基因進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果相似度均在95%以上，表明構(gòu)建成功且所獲得序列為PRVgE基因序列。其序列如下：

5'-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGC AGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACC GAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGG GCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGA GGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGAC GATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACC GCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTG AGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTC CGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCG ACGGCGCCGTGCCGGCCGGGATCTGGACGTTCCTG CCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGGTGACCAC GGTGTGCTTCGAGACCGCGTGCCACCCGGACCTGG TGCTGGGCCGCGCCTGCGTCCCCGAGGCCCCGGAG ATGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGGTGCC GCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACCCCG GAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCGGGC CACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTGCACG ACGCCTCGGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGTGGCGG TGGGCGACCGGCCGCCCGCGCCGGCGGACCCGGT GGGCCCCGCGCGCCACGAGCCCCGCTTCCACGCG CTCGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTCGCCCGGGGAC ACGTTCGACCTGATGCCGCGCGTGGTCTCGGACATG GGCGACTCGCGCGAGAACTTTACCGCCACGCTGGA CTGGTACTACGCGCGCGCGCCCCCGCGGTGCCTGC TGTACTACGTGTACGAGCCCTGCATCTACCACCCGC GCGCGCCCGAGTGCCTGCGCCCGGTGGACCCGGC GTGCAGCTTCACCTCGCCGGCGCGCGCGCGGCTGG TGGCGCGCCGCGCGTACGCCTCGTGCAGCCCGCTG CTCGGGGACCGGTGGCTGACCGCCTGCCCCTTCGA CGCCTTCGGCGAGGAGGTGCACACGAACGCCACCG CGGACGAGTCGGGGCTGTACGTGCTCGTGATGACC CACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCT CGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCATCA AGGAGCTGACGGCCCCGGCCCGGGCCCCGGGCAC CCCGTGGGGCCCCGGCGGCGGCGACGACGCGATC TACGTGGACGGCGTCACGACGCCGGCGCCGCCCGC GCACCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACGCCCG GGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTG ATGACGTGCGTCGTCGGGGGGGCCATCTGGCTCTG CGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGG CCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCGCGGACGCACA TGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCAC GAGGACTACTACGACGGCGACGACGACGACGACG AGGAGGCGGGCGTCATCCGCCGGCGGCCCGCCTC CCCCAGCGGAGACAGCGGCTACGAGGGGCCGTAC GCGAGCCTGGACCCCGAGGACGAGTTCAGCAGCG ACGAGGACGACGGGCTGTACGTGCGCCCCGAGGA GGCGCCCCGCTCCGGCTTCGACGTCTGGTTCCGCG ATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGACCCAA CTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCC GCCCCGCTTAA-3'

將所獲得的核苷酸序列所編碼的氨基酸進(jìn)行推導(dǎo)，結(jié)果如下：

MRPFLLRAAQLLALLALALSTEAPSLSAETTPG PVTEVPSPSAEVWDDLSTEADDDDLNGDLDGDDRR AGFGSALASLREAPPAHLVNVSEGANFTLDARGDGA VPAGIWTFLPVRGCDAVSVTTVCFETACHPDLVLGR ACVPEAPEMGIGDYLPPEVPRLRREPPIVTPERWSP HLSVLRATPNDTGLYTLHDASGPRAVFFVAVGDRPP APADPVGPARHEPRFHALGFHSQLFSPGDTFDLMP RVVSDMGDSRENFTATLDWYYARAPPRCLLYYVYE PCIYHPRAPECLRPVDPACSFTSPARARLVARRAYA SCSPLLGDRWLTACPFDAFGEEVHTNATADESGLY VLVMTHNGHVATWDYTLVATAAEYVTVIKELTAPA RAPGTPWGPGGGDDAIYVDGVTTPAPPAHPWNPY GRTTPGRLFVLALGSFVMTCVVGGAIWLCVLCSRRR AASRPFRVPTRARTHMLSPVYTSLPTHEDYYDGDD DDDEEAGVIRRRPASPSGDSGYEGPYASLDPEDE FSSDEDDGLYVRPEEAPRSGFDVWFRDPEKPEV TNGPNYGVTANRLLMSRPA.

2.2 PRV GZ-JS2017株gE基因的遺傳特征分析

測(cè)序結(jié)果表明，GZ-JS2017株gE基因完整編碼區(qū)長(zhǎng)1740 bp，可編碼579個(gè)氨基酸殘基，其中A+T = 26.03%，C+G = 73.97%。根據(jù)gE基因的核苷酸序列分析結(jié)果顯示：所收集的株序列中，變異區(qū)主要集中于140 bp～142 bp，國(guó)內(nèi)毒株均在其間插入ACG，1489 bp～1491 bp國(guó)內(nèi)毒株大部分插入了GAC；與所有毒株比對(duì)GZ-JS2017株在1250 bp出現(xiàn)了G→A(圖2)。由此推導(dǎo)，本次所分離毒株GZ-JS2017株經(jīng)gE基因序列分析發(fā)現(xiàn)在gE的aa 48和gE的aa 496均有1個(gè)天冬氨酸的插入。

圖2 PRV gE變異點(diǎn)比對(duì)Fig.2 Mutation loci alignment of gE gene of PRV

gE基因的核苷酸分析結(jié)果顯示PRV不同地域毒株之間同源率達(dá)98.8%～99.9%，而推導(dǎo)氨基酸序列同源率達(dá)98.3%～99.7%。其中，核苷酸同源性和氨基酸相似性均最高的是GZJS2017株與BJ-tiger-2012株、GDHS2株gE基因，核苷酸同源性為99.9%，氨基酸相似性為99.7%。結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 PRV gEI基因的核苷酸同源性比對(duì)Fig.3 Nucleotide homology alignment of gE gene of PRV

圖4 PRV gE基因所推導(dǎo)的氨基酸序列相似性比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment deduced from gE gene of PRV

將GZ-JS2017株與表1中所收集的序列應(yīng)用生物學(xué)信息軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建(圖5)。基于gE基因氨基酸序列的遺傳進(jìn)化分析得知：GZJS2017株與GDHS2株、HN-DZ株處于同一較小分支上，形成單獨(dú)的1個(gè)小亞群，推測(cè)這3株P(guān)RV具有較近血緣關(guān)系；與GZ-JS2017株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的是SXJC2011株，且SXJC2011株單獨(dú)處于一個(gè)支系。

圖5 PRV gE基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 phylogenetic tree of gE gene of PRV

3 討論與結(jié)論

在研究過(guò)程中，有研究人員將PRV變異毒株與經(jīng)典毒株相比較發(fā)現(xiàn)，在gE蛋白的第48位和第492位中各存在一個(gè)天冬氨酸(Asp)的插入，尤其是在第492位的一個(gè)天冬氨酸的插入可視作鑒定PRV變異株的分子特征[14]。在本研究中，作者選取GenBank中來(lái)源不同的毒株進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)位點(diǎn)的天冬氨酸插入與PRV毒株的分離年代和分離地區(qū)均無(wú)顯著的變化規(guī)律。此外，疫苗株(Bartha-K61)可對(duì)經(jīng)典株(PRV S株)提供完整的免疫保護(hù)，但對(duì)變異株(PRV-HeNI )則無(wú)法完全保護(hù)，這揭示了PRV經(jīng)典株和變異株之間存在著抗原性差異[15]。文中所研究的基因是從貴州省金沙縣某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)疑似感染PRV的豬腦組織、淋巴結(jié)及臟器混合樣本所分離出的毒株。經(jīng)gE基因序列分析發(fā)現(xiàn)在gE48位和gE496位均有1個(gè)天冬氨酸的插入，符合變異毒株基本特征。通過(guò)分析，GZ-JS2017株的gE基因與不同地域毒株之間的同源性達(dá)98.8%～99.9%，而推導(dǎo)氨基酸序列同源性達(dá)98.3%～99.7%。其中，核苷酸同源性和氨基酸相似性均最高的是BJ-tiger-2012株、GDHS2株gE基因，核苷酸同源性為99.9%，氨基酸相似性為99.7%。結(jié)果可為貴州地區(qū)的PRV的分子流行病學(xué)提供一定參考。

綜上，從文中g(shù)E基因結(jié)果可推測(cè)該毒株為變異毒株。在后續(xù)研究中，課題組將從gE基因遺傳變異規(guī)律和作用機(jī)理方面進(jìn)行研究，為進(jìn)一步預(yù)防、控制和根除豬偽狂犬病的發(fā)生和流行提供一定的參考依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1997：998-1856.

[2] B·E·斯特勞，S·D·阿萊爾，W·L·蒙加林，等.豬病學(xué)[M].8版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000：195-196.

[3] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].6版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1979：221-223.

[4] Fuchs W， Backovic M， Klupp B G，etal.Structure-based mutational analysis of the highly conserved domain IV of glycoprotein H of pseudorabies virus[J].JournalofVirology， 2012， 86(15)：8002.

[5] Wills E， Mou F， Baines J D.The UL31 and UL34 Gene Products of Herpes Simplex Virus 1 Are Required for Optimal Localization of Viral Glycoproteins D and M to the Inner Nuclear Membranes of Infected Cells[J].JournalofVirology， 2009， 83(10)：4800-4809.

[6] 余秋穎，常洪濤，陳文定.2012-2013年新流行豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及其gE、TK、gD基因序列分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34(10)：1573-1583.

[7] Prieto J，Martin Hennandez A M，Tabares E.Loss of pseudorabies virus thymidine kinase activity due to a single base mutation and amino acid substitution[J].JGenVirol，1991，72(5)：35-39.

[8] 陳華良，王和興，李小鵬，等.廣東地區(qū)豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查與gE、TK基因遺傳進(jìn)化分析[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2016，41(2)：5-9.

[9] 馬興杰.鑒別豬偽狂犬病病毒gE、gB、gG的納米PCR及熒光定量PCR方法的建立及評(píng)價(jià)[D].哈爾濱：哈爾濱獸醫(yī)研究所.

[10] 楊漢春.豬偽狂犬病的流行現(xiàn)狀與特點(diǎn)[J].豬業(yè)科學(xué)， 2016， 33(1)：38-38.

[11] 行 宇.河南部分地區(qū)豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[12] 劉吉山，李 峰，姚春陽(yáng)，等.豬偽狂犬病的流行特點(diǎn)與防控誤區(qū)[J].北方牧業(yè)，2015(15)：18-19.

[13] 李 寧，吳志明，閆若潛，等.2012-2014年河南省豬偽狂犬病病毒gE基因和TK基因的遺傳變異分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36(10)：1653-1657.

[14] 趙鴻遠(yuǎn)， 彭金美， 安同慶，等.豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其gE基因的分子特征[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36(07)：506-509.

[15] AN T Q， PENG J M， TIAN Z J，etal.Pseudorabies virus variabp in Bartha-K61-vaccinated pigs， China， 2012[J].EmergingInfectiousDiseases， 2013， 19(11)：1749.