易 瓊，馮樹(shù)丹，李昀樺，王 魯*

(1.貴州大學(xué) 貴州省生化工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

艾納香揮發(fā)油是艾納香植物在精制艾片過(guò)程中所產(chǎn)生的一種揮發(fā)油物質(zhì)，許多研究表明艾納香揮發(fā)油具有顯著的藥理學(xué)活性，其抗菌、消炎，鎮(zhèn)痛，組織修復(fù)等作用顯著，發(fā)展前景廣大[1-3]。其常溫為液體，容易揮發(fā)，水溶解度小，致使其劑型選擇較為局限，生物利用度也不高，制約了其推廣應(yīng)用[4]。因此，針對(duì)其現(xiàn)代生物藥劑學(xué)應(yīng)用上的不足，尋求一種適用于艾納香油的新劑型輔料，具有重要的臨床意義。有報(bào)道利用聚乙二醇為輔料將其制成口含滴丸用于急慢性咽炎的防治[5]，但艾納香揮發(fā)油-羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)包合物的制備還未見(jiàn)報(bào)道。HP-β-CD是一種水溶性極好(75 g/100ml)， 熱穩(wěn)定性好， 且無(wú)刺激性、無(wú)溶血作用的醫(yī)用輔料。它可將艾納香揮發(fā)油包合使其固化，增加藥物穩(wěn)定性， 改善藥物溶解度，提高其生物利用度，便于加入不同的基質(zhì)或敷料中制成各種劑型，拓展其應(yīng)用范圍。因此，本實(shí)驗(yàn)室以自制黔產(chǎn)的艾納香油為研究對(duì)象，運(yùn)用新型包合技術(shù)，以提高艾納香油的水溶性和穩(wěn)定性為目的，采用飽和水溶液法進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，制備艾納香揮發(fā)油/ HP-β-CD 精包合物，為下一步艾納香揮發(fā)油新制劑的研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

JB-3A型磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器廠)；觸點(diǎn)式溫度計(jì)(上海醫(yī)用儀器廠)；MultiskanGo型全波段酶標(biāo)儀(Thermo 公司)；冷凍干燥機(jī)(美國(guó)LABCONCO公司)；WHF-203B三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 試劑

2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)(粉末型，純度97%)(阿拉丁有限公司)；艾納香揮發(fā)油(貴州大學(xué)生化工程中心自制)；其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1艾納香揮發(fā)油的制備 稱取艾納香葉50 g，粉碎，過(guò)40目篩，放入1000 mL 圓底燒瓶中，加入10 倍的純水，浸泡1.5 h，然后根據(jù)文獻(xiàn)[6]和《中國(guó)藥典》2015 年版一部附錄XD 揮發(fā)油測(cè)定方法操作[7]，安裝揮發(fā)油提取器，采用蒸餾法工藝加熱提取5 h，再用無(wú)水硫酸鈉干燥即可。

1.3.2艾納香揮發(fā)油包合研究

1.3.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)前期查閱大量文[8-10]和反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步確定影響艾納香揮發(fā)油包合的主要因素有：艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD 之間的投料比、包合時(shí)間、包合溫度等，采用L9( 34)正交試驗(yàn)，以包合物油利用率、包合物含油率以及包合物產(chǎn)率為指標(biāo)，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行考察，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表Tab.1 orthogonal factor level table

1.3.2.2 艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合工藝 采用飽和水溶液法[11]，取適量HP-β-CD于圓底燒瓶中， 根據(jù)其溶解度加入一定量的水，使其溶解制備為HP-β-CD飽和水溶液，加入轉(zhuǎn)子后將其置于恒溫?cái)嚢杵魃系乃″佒斜３职蠝囟群愣ǎ儆媚z頭滴管吸取少量艾納香油-乙醇溶液[50%(v/v)]，緩慢加入到圓底燒瓶中，分次緩慢加入。為了防止艾納香油揮發(fā)，在圓底燒瓶上安裝一個(gè)冷凝回流裝置，開(kāi)始計(jì)時(shí)并將溶液在恒溫條件下攪拌一定時(shí)間，冷卻至室溫后置于冰箱中靜置24 h，濾過(guò)，再用石油醚洗滌(洗滌3次，每次10 ml)， 室溫放置并自然揮干約30 min，使其殘留的有機(jī)溶劑揮發(fā)后，置于冷凍干燥機(jī)中干燥，即得艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合物。

1.3.2.3 揮發(fā)油空白回收試驗(yàn) 根據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)附錄ⅩD 項(xiàng)下?lián)]發(fā)油測(cè)定法[7]，選取甲法測(cè)定，精密量取艾納香油一定量，置于500 mL的圓底燒瓶中，加水300～500 ml與沸石數(shù)粒，振搖混合后，按圖所示裝置連接好，加熱微沸5 h，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算供試品中揮發(fā)油的含量(%)。

圖1 揮發(fā)油檢測(cè)裝置Fig.1 Blumea balsamifera volatile Oil

1.3.2.4 包合物揮發(fā)油利用率、含油率及包合物產(chǎn)率的測(cè)定 取干燥包合物精密稱質(zhì)量，置圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，連接揮發(fā)油測(cè)定器，微沸并保持4.5 h，至油量不再增加時(shí)停止加熱，放置0.5 h，至揮發(fā)油呈淡黃色時(shí)讀數(shù)，得到揮發(fā)油體積。按下列公式計(jì)算包合物油利用率、包合物含油率以及包合物產(chǎn)率。為了便于結(jié)果的分析比較，將包合物油利用率、包合物含油率以及包合物產(chǎn)率合并為綜合評(píng)分，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響，最終確定最佳工藝條件。

包合物油利用率(%)即包合率 =[包合物中艾納香油的量(mL)/(艾納香油投料量(mL)×空白回收率)]×100%

包合物含油率(%)=[(包合物含油量(mL)×艾納香油密度(g/ml))/包合物重量(g)]×100%

包合物產(chǎn)率(%)=[干燥后包合物重量(mL)/(HP-β-CD投料量(g)+艾納香油投料量(mL))]×100%

綜合評(píng)分=包合物產(chǎn)率×0.3+包合物油利用率×0.5+包合物含油率×0.2

1.3.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取最佳包合工藝，取揮發(fā)油適量進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)6 次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重復(fù)性。

1.3.3包合物的質(zhì)量鑒定

1.3.3.1 薄層色譜法(TCL) 采用TLC法對(duì)艾納香揮發(fā)油包合前后的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證[12-13]。分別制備下列供試品溶液。供試品1：稱取HP-β-CD 0.1 g，加入蒸餾水1 mL，震蕩混勻即可；供試品2：取100 μL艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD1 mg混合，再加入無(wú)水乙醇1 mL，震蕩混勻后再用0.22 μm的濾芯過(guò)濾；供試品3：取適量的艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合物溶液；供試品4：取100 μL的艾納香揮發(fā)油，加入乙酸乙酯1 mL稀釋并混勻；供試品5：取適量的艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD包合物，裝入500 mL放入沸石的圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水，并連接揮發(fā)油提取器，冷凝回流至油量不再增加為止，將提取出的艾納香揮發(fā)油100 μL加入乙酸乙酯1 mL稀釋并搖勻；分別將上述供試品溶液用毛細(xì)管分別點(diǎn)于同一254 nm薄層熒光板上，以乙酸乙酯 -石油醚(1∶8)為展開(kāi)劑，將板置于展開(kāi)槽中展開(kāi)，揮干溶劑，觀察結(jié)果。

1.3.3.2 紫外掃描法(UV) 參考文獻(xiàn)[13-14]分別取適量1.3.3.1中的供試品1、2、3、4溶液，置于紫外分光光度計(jì)中，在 190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，測(cè)定吸光度結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾納香揮發(fā)油的提取

參照文獻(xiàn)方法可提取到艾納香油，收油率為3.14%，揮發(fā)油為淡黃色透明油狀物，具有特殊濃郁香味，如圖2所示。

圖2 艾納香油提取物Fig.2 Blumea balsamifera volatile Oil detector

2.2 艾納香揮發(fā)油包合研究

2.2.1艾納香油空白回收試驗(yàn) 取3組空白試驗(yàn)取其平均值，測(cè)得艾納香揮發(fā)油空白回收率為86.67%，取樣量及餾出量見(jiàn)表2。

表2 艾納香揮發(fā)油取樣量及餾出量Tab.2 The solution and distillate of Blumea balsamifera volatile oil

2.2.2最佳工藝條件的篩選 根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響主次。該正交試驗(yàn)極差R計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3，比較各R值大小，對(duì)于包合物產(chǎn)率、艾納香油的油利用率和綜合評(píng)分方面來(lái)說(shuō)，RA>RB>RC，而對(duì)于包合物制備過(guò)程的含油率來(lái)說(shuō)RB>RC>RA，所以因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序?yàn)锳、B、C， 即艾納香油與環(huán)糊精的比例對(duì)包合物的綜合影響最大，溫度其次，攪拌時(shí)間影響最小。經(jīng)方差分析結(jié)果表明，羥丙基-β-環(huán)糊精與艾納香油的投料量比例(即因素A)對(duì)油利用率和綜合評(píng)分有顯著影響，而其他因素對(duì)包合工藝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。綜合以上數(shù)據(jù)分析，直觀分析和方差分析結(jié)果，確定最佳工藝條件為A3B2C1，即艾納香油：HP-β-CD為1∶8，攪拌溫度為50℃，攪拌時(shí)間3 h。

表3 艾納香油-HP-β-CD包合工藝正交試驗(yàn)安排Tab.3 Orthogonal experiment L9(34) of Blumea balsamifera volatile oil-HP-β-CD inclusion technology

表4 以綜合評(píng)分為指標(biāo)的方差分析表Tab.4 The variance analysis table with the comprehensive score as index

F0.01(2，2)=99 F0.05(2，2)=19

2.2.3最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)2.2.4計(jì)算方法，包合物的平均產(chǎn)率為96.85%，平均油利用率為83.78%，平均含油率為8.32%，綜合平均得分為72.61，與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的各項(xiàng)指標(biāo)最高值相對(duì)較近，表明本實(shí)驗(yàn)所選取的工藝條件比較好，并且具有一定的可行性和重復(fù)性。

表5 最佳工藝重復(fù)驗(yàn)證Tab.5 the best technology repeatable validation

圖3 左為原樣圖，右為主要成分標(biāo)記圖Fig.3 The left is the original ,and the right is the main component

2.3 包合物的質(zhì)量鑒定

2.3.1薄層色譜法(TCL) 結(jié)果如圖3所示，供試品1和供試品3不顯斑點(diǎn)，而供試品2、供試品4和供試品5顯示相同的斑點(diǎn)，相對(duì)供試品2和供試品4，供試品5顯示斑點(diǎn)較弱，可能是餾出油的含量或成分發(fā)生了一些微小變化，綜合結(jié)果分析表明，艾納香油已嵌入 HP-β-CD的空穴結(jié)構(gòu)中形成了包合物，因此供試品3不顯示斑點(diǎn)，而供試品2、4、5斑點(diǎn)一致說(shuō)明包合前后艾納香油的性質(zhì)并未發(fā)生明顯改變，主成分也未發(fā)生較大變化。達(dá)到包合目的。

2.3.2紫外掃描法(UV) 結(jié)果如圖4所示，HP-β-CD溶液沒(méi)有艾納香揮發(fā)油的特征吸收，表明HP-β-CD 對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，艾納香揮發(fā)油-HP-β-CD 混合物、艾納香油、艾納香油-HP-β-CD包合物所形成的波譜圖基本一致，說(shuō)明三種溶液具有相似的紫外吸收?qǐng)D譜，并且HP-β-CD包合艾納香揮發(fā)油并未改變艾納香揮發(fā)揮發(fā)油的理化性質(zhì)。

圖4 波長(zhǎng)掃描圖Fig.4 wavelength scanning chart

3 結(jié)論與討論

當(dāng)前，環(huán)糊精包合技術(shù)發(fā)展已趨于成熟，歷年來(lái)也有許多HP-β-CD包合揮發(fā)油或其他藥物的實(shí)例，HP-β-CD作為一種安全無(wú)毒害的材料以及分子“內(nèi)疏水外親水”的特性，已廣泛應(yīng)用于中藥揮發(fā)油產(chǎn)品的制備，并且加快了醫(yī)藥美容等行業(yè)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，具有相當(dāng)可觀的發(fā)展前景[9]。

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響艾納香揮發(fā)油包合效果的主要因素為艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD的比例與包合溫度。為了考察這兩個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)包合工藝的影響程度，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，在保持其他條件不變的情況下， 對(duì)艾納香油與HP-β-CD的投料比和包合溫度分別做了進(jìn)一步單因素影響實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 當(dāng)HP-β-CD的投料量超過(guò)艾納香油投料量的10倍，包合時(shí)溫度超過(guò)60℃時(shí) ，包合率不僅不再增加， 甚至?xí)霈F(xiàn)下降的趨勢(shì)。投料比影響包合效果的原因可能為HP-β-CD過(guò)多時(shí)，其自身內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)阻礙了其對(duì)艾納香揮發(fā)油的包合作用；而當(dāng)HP-β-CD過(guò)少時(shí)，因艾納香揮發(fā)油過(guò)多，超過(guò)了HP-β-CD的空穴結(jié)構(gòu)承受范圍，導(dǎo)致一部分艾納香油不能被包合而裸露在外，造成損失引起包合率的降低。包合溫度影響包合效果的原因可能為當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，使得分子的熱運(yùn)動(dòng)加快，擴(kuò)散阻力減小，導(dǎo)致分子向外擴(kuò)散的速度加快， 包合過(guò)程中艾納香油的揮發(fā)損失增多導(dǎo)致包合率下降，而包合時(shí)間相對(duì)來(lái)說(shuō)影響不大。

本研究對(duì)艾納香揮發(fā)油包合物采用了TLC、UV等手段進(jìn)行表征分析，結(jié)果證明艾納香揮發(fā)油與HP-β-CD并非簡(jiǎn)單的物理混合，可能是艾納香揮發(fā)油包合進(jìn)入了HP-β-CD分子空穴內(nèi)，形成了一個(gè)新物象，即形成包合物，說(shuō)明本工藝適合艾納香揮發(fā)油包合物的制備，且此工藝操作簡(jiǎn)單，條件易于控制。并且，HP-β-CD包合揮發(fā)油可應(yīng)用溶液攪拌法、冷凍或噴霧干燥等工藝，易于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。其包合揮發(fā)油類物質(zhì)，不但增強(qiáng)了藥物的穩(wěn)定性和溶解度，且能提高揮發(fā)油類物質(zhì)的生物利用度，降低藥物毒性[8]，本研究中，將艾納香揮發(fā)油包合后，由液體藥物固體粉末化，便于制成多種劑型， 如可制成中藥片劑、膠囊劑、顆粒劑、袋泡劑和噴霧劑、滴眼劑、軟膏劑等多種劑型，這為艾納香揮發(fā)油新制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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