李 巖,楊曉東,秦 璐,呂光輝,何學(xué)敏, 張雪妮

1 新疆大學(xué)干旱生態(tài)環(huán)境研究所, 烏魯木齊 830046 2 綠洲生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830046 3 新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 烏魯木齊 830046 4 新疆環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院, 烏魯木齊 830011 5 新疆大學(xué)生態(tài)學(xué)博士后科研流動(dòng)站， 烏魯木齊 830046

土壤微生物是陸地土壤系統(tǒng)中極為重要和最為活躍的組成成分,在土壤的形成與發(fā)育、有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、生態(tài)系統(tǒng)平衡、土壤環(huán)境凈化、生物修復(fù)等方面起著不可替代的作用[1- 2]。微生物-植物-土壤之間存在著復(fù)雜的相互作用,根際是直接受植物根系和分泌物影響的土壤區(qū)域,是土壤微生物與植物相互作用的重要場(chǎng)所。根際土壤微生物,特別是一些對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的細(xì)菌和真菌,對(duì)植物生長(zhǎng)和抗逆性,如耐鹽性,發(fā)揮著重要作用[3- 7]。同時(shí),根際土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)也受到植物的影響,表現(xiàn)出一定的植物種類(lèi)特異性和生長(zhǎng)發(fā)育階段的特異性[8- 9]。植物活動(dòng)改變了根際土壤微環(huán)境,使得根際土壤與非根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成存在明顯差異[10- 11]。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也受土壤理化性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)狀況、水分等因子的影響[12- 13]。鹽堿環(huán)境條件下的土壤含鹽量和pH比非鹽堿土高,土壤鹽分對(duì)土壤微生物群落的活性、多樣性和結(jié)構(gòu)存在顯著的影響[13- 14]。作為生長(zhǎng)在鹽堿地中的植物類(lèi)群,鹽生植物在長(zhǎng)期的適應(yīng)和進(jìn)化過(guò)程中,形成了獨(dú)特的耐鹽機(jī)制,以應(yīng)對(duì)鹽堿對(duì)自身的不利影響,除植物本身的應(yīng)對(duì)機(jī)制外,根際微生物以及一些內(nèi)共生菌對(duì)植物的耐鹽性也起到了一定的作用[4, 14]。開(kāi)展鹽生植物根際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)研究有助于深入理解鹽生植物的耐鹽性及其與根際土壤微生物間的相互作用。在過(guò)去10年間,人們對(duì)非鹽生植物在正常條件或鹽脅迫條件下的根系微生物多樣性開(kāi)展了較多研究,然而,缺少對(duì)鹽生植物根系土壤微生物群落組成的研究[7]。

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)和里海鹽爪爪(Kalidiumcaspicum)是兩種分布于我國(guó)西北干旱區(qū)的鹽生植物,其中里海鹽爪爪在國(guó)內(nèi)僅分布于新疆。這兩種植物多見(jiàn)于荒漠地區(qū)的鹽漬化土壤中,均具有很強(qiáng)的耐鹽堿性。國(guó)內(nèi)學(xué)者從生理生態(tài)方面對(duì)它們的耐鹽堿機(jī)理開(kāi)展過(guò)研究[15- 17],但關(guān)于它們的根際土壤微生物多樣性以及根際土壤微生物與耐鹽性之間的關(guān)系方面還缺少深入研究。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù),分析黑果枸杞和里海鹽爪爪根際與非根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),以及根際土壤中細(xì)菌群落之間的相似性和差異性,從而揭示它們根際土壤細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步揭示根際土壤細(xì)菌與兩種鹽生植物耐鹽性之間的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

調(diào)查區(qū)位于新疆精河縣西北部的準(zhǔn)噶爾盆地西南的艾比湖濕地國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。該區(qū)氣候干燥、降雨少、地表蒸發(fā)強(qiáng)烈;土壤鹽分高、堿性強(qiáng),淺層(0—10 cm)土壤的平均電導(dǎo)率為5.41 ms/cm,pH值為8.77;土壤平均容重約1.38 g/cm3,含水量平均為7.19%。該區(qū)分布有胡楊(Populuseuphratica)、檉柳(Tamarixramosissima)、梭梭(Haloxylonammodendron)、鹽穗木(Halostachyscaspica)、鹽節(jié)木(Halocnemumstrobilaceum)、堿蓬(Suaedaglauca)、鹽爪爪(Kalidiumfoliatum)、里海鹽爪爪(K.caspicum)、黑果枸杞(Lyciumruthenicum)等多種耐旱、耐鹽植物[18]。

土壤樣品于2016年8月采自精河縣艾比湖濕地國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的鹽堿地。里海鹽爪爪群落和黑果枸杞群落相距大約2 km, 分別在里海鹽爪爪、黑果枸杞居群中選擇生長(zhǎng)狀況相近的健康個(gè)體(具有相近遺傳背景,個(gè)體高度、冠幅基本一致),里海鹽爪爪采集3個(gè)個(gè)體,黑果枸杞5個(gè)個(gè)體,個(gè)體之間距離大約30—50 m。將植株根系挖出,抖去根部附著比較疏松的土壤,留下與根系結(jié)合比較緊密的土壤(厚度約1 mm),裝入50 mL無(wú)菌離心管中,于冷藏條件帶回實(shí)驗(yàn)室。加入適量無(wú)菌PBS溶液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.5 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4, pH 7.3), 漩渦震蕩10 min,棄去根系,土壤溶液即為植株根際土壤溶液,儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆?。非根際土壤與根際土壤取自同一地點(diǎn)和同一時(shí)間,撇去表層土,收集0—30 cm土層的土壤,裝于無(wú)菌保鮮袋中, 于冰上帶回實(shí)驗(yàn)室,儲(chǔ)存于4℃,備土壤總DNA提取。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)分析

土壤pH和電導(dǎo)率(EC)分別采用pH計(jì)和電導(dǎo)率儀測(cè)定,土壤有機(jī)碳(TOC)和有機(jī)質(zhì)(SOM)采用重鉻酸鉀容重法進(jìn)行測(cè)定,全氮(TON)采用重鉻酸鉀-硫酸消化法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 土壤微生物基因組DNA的提取

提取基因組DNA時(shí),吸取1 mL根際土壤溶液至2 mL無(wú)菌離心管中,于4℃、10000g離心30 s,棄上清,所得沉淀用于根際土壤微生物基因組DNA提取;對(duì)非根際土,用無(wú)菌藥匙取大約0.2 g土壤,加入2 mL無(wú)菌離心管中,用于提取基因組DNA。利用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA)提取基因組DNA,利用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的長(zhǎng)度和完整性,利用NanoDrop檢測(cè)DNA的濃度和純度。

1.2.3 DNA擴(kuò)增及測(cè)序

采用兩輪法對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增, 第一輪擴(kuò)增利用融合了barcode序列的通用引物進(jìn)行,上游引物341F：ccctacacgacgctcttccgatctg (barcode) cctacgggnggcwgcag,下游引物805R: gactggagttccttggcacccgagaattccagactachvgggtatctaatcc,反應(yīng)體系30 μL,包含15 μL 2×Taq master Mix(Thermo),上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板DNA 20 ng。擴(kuò)增條件：94℃ 3 min,94℃ 30 s,45℃ 20 s,65℃ 30 s,擴(kuò)增5個(gè)循環(huán);94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 30 s,擴(kuò)增20循環(huán),72℃延伸5 min。第二輪擴(kuò)增使用Illumina橋式PCR兼容引物,反應(yīng)體系同上,擴(kuò)增條件：95℃ 30 s,95℃ 15 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s,擴(kuò)增5個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)磁珠法回收后,送至生工(上海)生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序,重復(fù)樣品的PCR產(chǎn)物等量混合,每個(gè)混合樣品包含所有重復(fù),共測(cè)序4個(gè)樣品,分別為兩種植物的根際和非根際土壤樣品。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序原始數(shù)據(jù)去除引物接頭序列、去除各低質(zhì)量堿基(Phred Quality Score=20)后進(jìn)行拼接,舍棄長(zhǎng)度短于200 bp的序列,去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體后,得到每個(gè)樣本的有效序列數(shù)據(jù)。采用Mothur 1.30軟件包以97%為劃定閾值,對(duì)16S序列劃分操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)。采用RDP classifier 2.12 對(duì)97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息,并在界、門(mén)、綱、目、科、屬水平上統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品的細(xì)菌群落組成?；谖锓N分類(lèi)分析,繪制物種分類(lèi)條形圖和物種豐度熱圖。利用QIIME 1.8軟件進(jìn)行樣品Alpha多樣性分析,計(jì)算ACE、Chao1、Shannon、Simpson等物種多樣性指數(shù)?；贏lpha多樣性指數(shù)進(jìn)行稀釋性分析。通過(guò)unifrac分析,評(píng)估樣本的Beta多樣性,根據(jù)樣本之間weighted unifrac距離,繪制樣本聚類(lèi)樹(shù)。采用CCA分析影響細(xì)菌物種群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

土壤樣品理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。兩種鹽生植物的根際土壤有機(jī)碳(TOC)、有機(jī)質(zhì)(SOM)、總氮(TON)含量均高于非根際土壤,其pH值均低于非根際土壤。黑果枸杞群落的非根際土壤的TOC、SOM和TON含量、電導(dǎo)率均高于里海鹽爪爪群落的土壤,但其pH低于后者;里海鹽爪爪的根際土壤的TOC、SOM和TON含量、電導(dǎo)率則高于黑果枸杞根際土,pH則相反。黑果枸杞根際土壤電導(dǎo)率低于非根際土,而里海鹽爪爪根際土電導(dǎo)率略高于非根際土壤。

表1 根際土壤與非根際土壤的理化性質(zhì)

數(shù)值格式：平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)Mean (Std. Deviation);*：由于根際土樣品量太少,將每個(gè)重復(fù)的根際土壤混合后進(jìn)行測(cè)定,只有一個(gè)值,未計(jì)算偏差,以“-”表示

2.2 細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

研究測(cè)得的有效序列長(zhǎng)度在400—440 bp之間, 平均長(zhǎng)度420 bp左右。經(jīng)土壤DNA基因組序列分析,從黑果枸杞和里海鹽爪爪的根際土壤和非根際土壤中測(cè)定和分析出的序列數(shù)分別為27501條、18801條、21198條和35367條,有效OTU數(shù)分別為1081、1591、1788和1294(表2)?；赟hannon指數(shù)的稀釋曲線(圖1)表明,樣品稀釋曲線均基本趨于平緩,說(shuō)明取樣基本合理,能夠比較真實(shí)地反映土壤樣本的細(xì)菌群落,另外,測(cè)序覆蓋率均高于90%,也表明本次測(cè)序深度合理,基本能代表樣本的真實(shí)情況(表2)。

表2 土壤樣品基因組DNA測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及alpha多樣性分析

圖1 相似度為0.97條件下各土壤樣品中細(xì)菌群落的alpha指數(shù)(Shannon)稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil bacterial community (at 97% identity) constructed with Shannon indexL. r_R：黑果枸杞根際土壤細(xì)菌,bacterial community in rhizosphere soil of L. ruthenicum; L. r_B： 黑果枸杞非根際土壤細(xì)菌,bacterial community in bulk soil of L. ruthenicum;K.c_R：里海鹽爪爪根際土壤細(xì)菌,bacterial community in rhizosphere soil of K. caspicum;K.c_B：里海鹽爪爪非根際土壤細(xì)菌,bacterial community in bulk soil of K. caspicum

2.2.2 細(xì)菌多樣性

測(cè)定的鹽生植物根際和非根際土壤細(xì)菌的Alpha多樣性結(jié)果見(jiàn)表2。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表明,根際土壤細(xì)菌多樣性顯著高于非根際土壤(P<0.01);黑果枸杞根際土壤細(xì)菌多樣性高于里海鹽爪爪,但差異不顯著(P>0.05),但其ACE、Chao1指數(shù)低于里海鹽爪爪,說(shuō)明黑果枸杞根際土壤細(xì)菌豐度低于里海鹽爪爪;兩種植物的非根際土壤細(xì)菌多樣性無(wú)顯著差異(P>0.05)

2.2.3 細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)

根據(jù)土壤基因組DNA序列的分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果,從所有供試土壤樣品中共檢測(cè)出細(xì)菌30門(mén)、55綱、88目、202科、672屬。優(yōu)勢(shì)門(mén)(豐度>1%)數(shù)量少,非優(yōu)勢(shì)門(mén)數(shù)量多(圖2)。在檢測(cè)到的30個(gè)門(mén)中,變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在所有土壤樣品中均為優(yōu)勢(shì)門(mén),豐度分別為37.26%—81.65%和1.73%—45.67%。從黑果枸杞和里海鹽爪爪根際土壤中分別檢測(cè)出細(xì)菌21和22門(mén),從非根際土壤中分別檢測(cè)出28和24門(mén)。根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)數(shù)量多于非根際土壤,在根際土壤細(xì)菌中共檢測(cè)出6個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén),其中黑果枸杞根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)有6個(gè),豐度從大到小分別為變形菌門(mén)(37.26%)、厚壁菌門(mén)(33.07%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)(16.08%)、放線菌(Actinobacteria)(5.27%)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)(4.32%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)(1.07%),其他16門(mén)的豐度均低于1%,其中Deinococcus-Thermus等10個(gè)門(mén)的豐度低于0.1%;里海鹽爪爪根際土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)門(mén)有變形菌門(mén)(81.65%)、厚壁菌門(mén)(1.73%)、擬桿菌門(mén)(8.55%)和放線菌門(mén)(4.33%)4個(gè)門(mén), 其他18門(mén)的豐度均低于1%,其中Parcubacteria等12個(gè)門(mén)的豐度低于0.1%;從非根際土壤細(xì)菌中檢測(cè)出2個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén),即變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén),占非根際土壤細(xì)菌總數(shù)的90%以上,在黑果枸杞的非根際土壤中的豐度分別為52.68%和45.67%,在里海鹽爪爪非根際土壤中豐度分別為55.4%和43.22%,而其他門(mén)的豐度均少于1%,其中豐度低于0.1%的各有23和19個(gè)。

在屬分類(lèi)水平上,從黑果枸杞和里海鹽爪爪兩種鹽生植物的根際土壤中分別檢測(cè)出289和304個(gè)屬,而在非根際土壤中分別檢測(cè)出285和336個(gè)屬,優(yōu)勢(shì)屬占比很低;在根際和非根際土壤中的優(yōu)勢(shì)屬數(shù)量和組成也不同,其中在根際土壤中的優(yōu)勢(shì)屬數(shù)量多于非根際土壤。在黑果枸杞和里海鹽爪爪根際土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬分別有10個(gè)和9個(gè),而在非根際土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬有4個(gè),僅假單胞菌屬(Pseudomonas)在根際和非根際土壤中均為優(yōu)勢(shì)屬(圖2)。在黑果枸杞根際土壤中的10個(gè)優(yōu)勢(shì)屬按豐度順序依次為：動(dòng)性球菌屬(Planococcus,26.92%)、鹽單胞菌屬(Halomonas,16.7%)、Pontibacter(6.58%)、假單胞菌屬(5.34%)、Streptophyta(4.32%)、Salinimicrobium(4.1%)、Planomicrobium(2.45%)、芽孢桿菌屬(Bacillus, 1.77%)、Gillisia(1.4%)、Thioalkalispira(1.37%);在里海鹽爪爪根際土壤中的9個(gè)優(yōu)勢(shì)屬按豐度順序依次為動(dòng)性球菌屬(28.39%)、鹽單胞菌屬(14.47%)、Fodinicurvata(12.24%)、Massilia(4.19%)、Aliifodinibius(3.56%)、Cobetia(2.45%)、Aidingimonas(1.63%)、Gracilimonas(1.51%)、微小桿菌屬(Exiguobacterium,1.17%);在兩種供試鹽生植物非根際土壤中的4個(gè)優(yōu)勢(shì)屬依次為微小桿菌屬(44.01%、41.45%)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter,28.07%、29.49%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter,13.3%、13.51%)、假單胞菌屬(8.09%、9.33%),其中微小桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和檸檬酸桿菌屬在根際土壤細(xì)菌中的豐度均顯著降低(0.25%—1.17%),而一些低豐度屬(如動(dòng)性球菌屬、鹽單胞菌屬、Pontibacter、Salinimicrobium等)則在根際土壤中顯著增高,成為優(yōu)勢(shì)屬,表明黑果枸杞和里海鹽爪爪兩種植物的根際土壤細(xì)菌的群落組成和豐度與非根際土壤存在較大的差異。

圖2 門(mén)和屬水平上的土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 The bacterial community structures of soil samples at levels of phylum and genus 門(mén)圖例(自上而下、自左至右,僅列出有對(duì)應(yīng)中文名稱(chēng)的門(mén))：變形菌門(mén)Proteobacteria;厚壁菌門(mén)Firmicutes;擬桿菌門(mén)Bacteroidetes;放線菌門(mén)Actinobacteria;藍(lán)細(xì)菌門(mén)Cyanobacteria;浮霉菌門(mén)Planctomycetes;分類(lèi)未定unclassified;酸桿菌門(mén)Acidobacteria;疣微菌門(mén)Verrucomicrobia;綠彎菌門(mén)Chloroflexi;異常球菌-棲熱菌門(mén)Deinococcus-Thermus;芽單胞菌門(mén)Gemmatimonadetes;硝化螺旋菌門(mén)Nitrospirae;熱脫硫桿菌門(mén)Thermodesulfobacteria;衣原體門(mén)Chlamydiae;熱袍菌門(mén)Thermotogae;螺旋體門(mén)Spirochaetes;梭桿菌門(mén)Fusobacteria;綠菌門(mén)Chlorobi;纖維桿菌門(mén)Fibrobacteres; 屬圖例(自上而下、自左至右,僅列出有對(duì)應(yīng)中文名稱(chēng)的屬)：微小桿菌屬Exiguobacterium;檸檬酸桿菌屬Citrobacter;假單胞菌屬Pseudomonas;不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter;鹽單胞菌屬Halomonas;動(dòng)性球菌屬Planococcus;分類(lèi)未定unclassified;芽孢桿菌Bacillus;小紅卵菌屬Rhodovulum;考克氏菌屬Kocuria;根瘤菌屬M(fèi)esorhizobium;氮單胞菌屬Azomonas

2.2.4 細(xì)菌群落相似性及差異性分析

植物的根際土壤與非根際土壤細(xì)菌群落之間,以及不同植物的根際土壤細(xì)菌在群落組成和豐度上都存在顯著差異。在門(mén)水平上,擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)在根際土壤中的豐度顯著高于非根際土壤,而厚壁菌門(mén)的豐度則低于非根際土壤(圖2, 附圖1A, B)。變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、酸桿菌門(mén)豐度在兩種植物的根際土壤中的豐度也具有顯著的差異(圖2, 附圖1C),而非根際土壤細(xì)菌豐度在門(mén)水平上差異較小。在屬水平上的細(xì)菌多樣性豐度圖(圖3)顯示,與根際土壤細(xì)菌群落相比,非根際土壤中的4個(gè)優(yōu)勢(shì)屬組成相同,而且豐度也基本一致,除假單胞菌屬外,不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、微小桿菌屬 3個(gè)優(yōu)勢(shì)屬的豐度在根際土壤細(xì)菌群落中顯著降低(附圖2A, B)。另外,多個(gè)非優(yōu)勢(shì)屬的豐度也在根際土壤中下降,甚至消失,如氮單胞菌屬(Azomonas)、Brevundimonas、Enterococcus、Kluyvera等;與之相反,許多屬的豐度在根際土壤中則顯著增加,如鹽單胞菌屬、Streptophyta、Aliifodinibius、Gracilimonas等;動(dòng)性球菌屬、Pontibacter、Thioalkalispira、Cobetia和Aidingimonas是根際土壤中的特有屬,在非根際菌群中未檢測(cè)到(圖3)。

圖3 各土壤樣品中在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)熱度圖及聚類(lèi)圖 Fig.3 The heatmap and clustering map of bacterial community structures of soil samples at level of genus熱度圖列代表樣本,行代表群落結(jié)構(gòu),顏色塊代表相對(duì)物種豐度值(由藍(lán)到紅,相對(duì)豐度逐漸升高),只顯示豐度最高的前50個(gè)屬,剩余的合并成other; 熱圖上方的分支結(jié)構(gòu)為樣品聚類(lèi)樹(shù)

通過(guò)對(duì)兩種植物根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較,發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬和鹽單胞菌屬兩屬為這兩種植物根際土壤中的共有優(yōu)勢(shì)屬(圖2),假單胞菌屬在黑果枸杞根際土壤的豐度(5.34%)顯著低于里海鹽爪爪根際土壤(28.39%)。動(dòng)性球菌屬、Planomicrobium、Pontibacter、Salinimicrobium、芽孢桿菌屬、Gillisia及Thioalkalispira是黑果枸杞根際土壤中的優(yōu)勢(shì)屬,豐度為1.37%—26.92%,但在里海鹽爪爪根際土壤中的豐度為0—0.49%;Aliifodinibius、微小桿菌屬、Gracilimonas、Massilia、Fodinicurvata、Cobetia及Aidingimonas為里海鹽爪爪根際土壤中的優(yōu)勢(shì)屬,豐度為1.17%—12.23%,但在黑果枸杞根際土壤中的豐度為0.07%—0.95%,它們?cè)诟H和非根際土壤中的豐度具有顯著差異(附圖2C)。黑果枸杞和里海鹽爪爪兩種植物的遺傳背景不同,其根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和豐度也不同,表明不同植物即使在同一種鹽堿環(huán)境條件下,它們的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成明顯不同,植物種類(lèi)的不同是影響其根際土壤細(xì)菌多樣性的重要因子。

黑果枸杞和里海鹽爪爪的根際土壤細(xì)菌群落之間的unifrac距離為0.44,而二者的非根際土壤細(xì)菌群落之間的距離為0.04,二者根際土壤與非根際土壤細(xì)菌群落間的距離分別為0.69和0.65。由聚類(lèi)圖(圖3)可以看出,黑果枸杞和里海鹽爪爪的根際土壤細(xì)菌群落聚為一個(gè)分支,二者的非根際土壤細(xì)菌群落聚為一個(gè)分支,表明兩種植物的根際土壤細(xì)菌群落之間的相似性大于根際土壤和非根際土壤細(xì)菌群落間的相似性。

表3 兩種植物根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性

2.2.5 細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

圖4 兩種植物根際土壤細(xì)菌群落組成與土壤理化因子的CCA分析圖Fig.4 CCA analysis of two plants′ rhizosphere soil bacterial community composition and soil chemical factors

通過(guò)對(duì)二種植物根際土壤細(xì)菌多樣性與土壤理化因子之間相互關(guān)系的分析,發(fā)現(xiàn)根際土壤細(xì)菌多樣性的Shannon、ACE、Chao 1指數(shù)與TOC、SOM和TON呈正相關(guān)關(guān)系(表3),但與pH和EC呈負(fù)相關(guān),但相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。通過(guò)對(duì)二種植物根際土壤細(xì)菌群落(物種)組成與土壤理化因子CCA間的關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率和pH,TOC和TON分別是非根際土壤,根際土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因子(圖4)。

3 討論

植物對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有主動(dòng)選擇性[19],植物通過(guò)根系活動(dòng)改變根際環(huán)境,從而有選擇性地提高或降低某些根際土壤細(xì)菌類(lèi)群的豐度或多樣性,使有益于植物自身生長(zhǎng)的細(xì)菌種類(lèi)的豐度增加,而不利于自身生長(zhǎng)的細(xì)菌種類(lèi)減少甚至消失,從而形成有益于自身的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),導(dǎo)致不同植物具有不同的根際細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)[8]。 如Comamonadaceae、Flavobacteriaceae、Rhizobiaceae 是大麥根際土壤細(xì)菌的主要類(lèi)群[20];變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和酸桿菌門(mén)是菊芋根際土壤中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群[21];厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)是西瓜根際土壤中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群[22]。

黑果枸杞和里海鹽爪爪的根際土壤與非根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和群落組成具有顯著差異。Alpha多樣性分析表明,植物根際土壤細(xì)菌多樣性高于非根際土壤,這與其他植物的相關(guān)研究成果[23- 24]相一致。變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在植物根際和非根際土壤中均為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,但變形菌門(mén)的豐度更高于厚壁菌門(mén),變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)細(xì)菌是我國(guó)許多鹽漬化土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群[25],這兩個(gè)門(mén)細(xì)菌在多種植物根際土壤中也是優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,如菊芋[21]、葡萄[26]、紅蕓豆[27]、Stellerachamaejasme[28]。變形菌門(mén)包括多樣的病原菌和固氮菌,厚壁菌門(mén)細(xì)菌可發(fā)生于多種環(huán)境中,其中許多細(xì)菌可耐受極端條件,如干旱、鹽堿等環(huán)境,常與植物的抗耐逆性有關(guān),厚壁菌門(mén)在黑果枸杞和里海鹽爪爪根際土壤中的豐度在30%以上,高于葡萄[26]、野燕麥[11]等非鹽生植物,表明該類(lèi)群細(xì)菌適宜鹽堿環(huán)境的生長(zhǎng)和繁殖,具有較強(qiáng)的抗耐鹽性。非根際土壤中的大部分細(xì)菌門(mén)的豐度較低(<0.1%),然而擬桿菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、疣微菌門(mén)、放線菌門(mén)在根際土壤中的豐度均有提高。

聚類(lèi)分析表明, 兩種植物根際細(xì)菌群落的相似性高于根際土壤與非根際土壤之間的相似性,暗示在鹽堿化脅迫下兩種植物趨向于選擇和形成相似的根際土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu),可能是鹽生植物在長(zhǎng)期的鹽堿脅迫下,形成的一種對(duì)根際細(xì)菌群落的趨同性選擇機(jī)制。兩種植物根際土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的數(shù)量多于非根際土壤,非根際土壤的優(yōu)勢(shì)屬有3個(gè),不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、微小桿菌屬,但它們?cè)诟H土壤中的豐度均顯著降低;而在非根際土壤中的低豐度屬,如動(dòng)性球菌屬、鹽單胞菌屬、Salinimicrobium等,在根際土壤中則為優(yōu)勢(shì)屬。與非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相比,根際土壤細(xì)菌豐度增加的種類(lèi)大多具有抗耐鹽性,微小桿菌屬中有些種類(lèi)具有耐鹽性(可耐受NaCl濃度為13%),適生pH 5—11[29];鹽單胞菌屬為嗜鹽菌,可以在5%—25% NaCl環(huán)境中生長(zhǎng)[30];Salinimicrobium分布于鹽漬化土壤中,可以耐受含1%—3% NaCl脅迫[31];Fodinicurvata是一類(lèi)嗜鹽菌,可在鹽分含量5%—20%的土壤中生存[32]。假單胞菌屬是鹽堿土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群,是一種耐鹽堿菌群, 大多數(shù)種不需要有機(jī)生長(zhǎng)因子,同時(shí)還可降解環(huán)境中廣泛存在的多種有機(jī)分子[33]。

兩種植物根際細(xì)菌群落組成具有相似性,同時(shí)也具有一定的差異,表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度不同,低豐度菌群組分不同, 這反映了根際群落結(jié)構(gòu)的植物特異性。每種植物有自己的遺傳背景和物質(zhì)代謝過(guò)程,兩種植物根際分泌物的種類(lèi)、數(shù)量不同,根際土壤微環(huán)境不同,如根際土壤理化性質(zhì)(表1)所示,SOM、pH、EC差異顯著。黑果枸杞根際土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)數(shù)多于里海鹽爪爪,雖然從兩種植物根際土壤中檢測(cè)出的細(xì)菌屬總數(shù)和優(yōu)勢(shì)屬數(shù)目幾乎相同,但其具體種類(lèi)和豐度均具有很大差異,僅假單胞菌屬和鹽單胞菌屬是兩種植物根際土壤共有的優(yōu)勢(shì)屬,且假單胞菌屬在黑果枸杞根際土壤中的豐度顯著低于里海鹽爪爪根際土壤。動(dòng)性球菌屬、Pontibacter等是黑果枸杞根際土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬,它們的豐度明顯高于里海鹽爪爪根際土壤中的豐度;而Aliifodinibius、微小桿菌屬、Gracilimonas等是里海鹽爪爪根際土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬,它們的豐度明顯高于黑果枸杞根際土壤中的豐度。無(wú)論是優(yōu)勢(shì)屬,還是低豐度屬,它們?cè)谥参锔H土壤和非根際土壤中均存在顯著差異,尤其在兩種植物的根際土壤中存在的差異更大,說(shuō)明低豐度細(xì)菌類(lèi)群比高豐度類(lèi)群細(xì)菌對(duì)土壤環(huán)境更敏感[25]。

在鹽漬化地區(qū),含鹽量是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要限制因子,對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有顯著影響[21]。干旱區(qū)鹽堿化土壤養(yǎng)分含量低,且鹽分含量高、堿性高,不利于土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖。鹽分脅迫會(huì)降低植物根際土壤細(xì)菌的多樣性[34-35],然而,對(duì)耐鹽植物而言,鹽脅迫可增加根際土壤細(xì)菌多樣性和生物量[36],這可能是由于鹽分的升高促進(jìn)了耐鹽或嗜鹽細(xì)菌的增殖[21]。本研究發(fā)現(xiàn),黑果枸杞和里海鹽爪爪兩種植物的根際土壤的有機(jī)碳、有機(jī)質(zhì)、總氮含量均高于非根際土壤,根際土壤細(xì)菌多樣性亦高于非根際土壤,而相關(guān)性分析也證明土壤細(xì)菌的多樣性與有機(jī)碳、有機(jī)質(zhì)、總氮含量呈正相關(guān),而與電導(dǎo)率和pH呈負(fù)相關(guān);含鹽量和pH是非根際土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因子,而土壤有機(jī)質(zhì)和總氮含量是根際土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因子, 這與以往研究一致[37]。植物根際土壤有機(jī)質(zhì)增加、pH降低、細(xì)菌豐度增加,這一結(jié)果表明耐鹽植物根系可以緩解土壤鹽漬化的脅迫效應(yīng),并為相應(yīng)細(xì)菌生長(zhǎng)提供更有利的微生境[25],同時(shí),植物根際土壤細(xì)菌可以緩解土壤鹽分對(duì)植物的脅迫作用[38]。

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附圖1 黑果枸杞和里海鹽爪爪根際和非根際土壤中細(xì)菌群落組成在門(mén)水平的差異分析Fig.S1 The differential analysis of bacterial community composition between rhizosphere and bulk soil of L. ruthenicum and K. caspicum at level of phylumA：黑果枸杞根際vs非根際菌群;B：里海鹽爪爪根際vs非根際菌群;C：黑果枸杞根際菌群vs里海鹽爪爪根際菌群;L. r_R：黑果枸杞根際土壤細(xì)菌,bacterial community in rhizosphere soil of L. ruthenicum; L. r_B： 黑果枸杞非根際土壤細(xì)菌,bacterial community in bulk soil of L. ruthenicum;K.c_R：里海鹽爪爪根際土壤細(xì)菌,bacterial community in rhizosphere soil of K. caspicum;K.c_B：里海鹽爪爪非根際土壤細(xì)菌,bacterial community in bulk soil of K. caspicum

附圖2 黑果枸杞和里海鹽爪爪根際和非根際土壤細(xì)菌群落組成在屬水平的差異分析Fig.S2 The differential analysis of bacterial community composition between rhizosphere and bulk soil of L. ruthenicum and K. caspicum at level of genusL. r_R：黑果枸杞根際土壤細(xì)菌,bacterial community in rhizosphere soil of L. ruthenicum; L. r_B： 黑果枸杞非根際土壤細(xì)菌,bacterial community in bulk soil of L. ruthenicum;K.c_R：里海鹽爪爪根際土壤細(xì)菌,bacterial community in rhizosphere soil of K. caspicum;K.c_B：里海鹽爪爪非根際土壤細(xì)菌,bacterial community in bulk soil of K. caspicum