薛 閣,李 洋,陳勁松,宋會(huì)興,*

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院, 成都 611130 2 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 成都 610101

由于克隆生長,同一克隆片段內(nèi)的分株通過匍匐莖、根狀莖等水平結(jié)構(gòu)連接在一起,并且相連分株間存在物質(zhì)傳遞(如光合產(chǎn)物、水分、養(yǎng)分等),這被稱為克隆整合(clonal integration)[1]。對(duì)光合產(chǎn)物、礦質(zhì)養(yǎng)分、水分等物質(zhì)的克隆整合格局同位素示蹤以及染料標(biāo)記等的研究結(jié)果表明,同化產(chǎn)物在克隆片段內(nèi)既可以頂向傳輸(acropetal transport),即流向遠(yuǎn)端分株(distal ramet);也可以基向傳輸(basipetal transport),即流向近端分株(proximal ramet)[2]。因此,克隆整合可能是克隆植物維持生態(tài)優(yōu)勢(shì)的重要手段,其通過分株間生理整合緩解資源異質(zhì)性(光照等)帶來的壓力。

釋放到根際環(huán)境中的植物根系分泌物被認(rèn)為是投入到土壤中易分解碳最主要的來源[3]。這些易分解的有機(jī)質(zhì)成為異養(yǎng)根際微生物重要的能量來源、結(jié)構(gòu)物質(zhì),能夠促進(jìn)根系微生物的快速生長和繁殖[4]。土壤有機(jī)質(zhì)礦化作用是受土壤酶催化的復(fù)雜生物化學(xué)過程,這其中土壤酶主要來源于土壤微生物[5-6]。土壤微生物代謝活動(dòng)產(chǎn)生的酶類,一部分參與自身生理代謝,另一部分通過排泄或分泌到土壤基質(zhì)中,被認(rèn)為是為土壤微生物活性的敏感指示[7]。因此,根際生態(tài)過程(如有機(jī)質(zhì)降解等)及養(yǎng)分有效性可能受到土壤微生物活性及其群落結(jié)構(gòu)變化的影響。

土壤是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng),關(guān)于土壤代謝過程(有機(jī)質(zhì)降解、硝化過程、土壤呼吸等)以及特定土壤酶活性(脲酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶等)的研究,間接揭示了土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)中的重要作用[8]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主要由群落的種類和種間差異來描述。土壤微生物通常種類繁多、數(shù)量巨大,加之土壤介質(zhì)本身的復(fù)雜多變,傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法僅僅能篩選出極少數(shù)的土壤微生物(1%—10%),而絕大多數(shù)土壤微生物在實(shí)驗(yàn)室條件下難以培養(yǎng)、鑒定[9]。20世紀(jì)90年代以來,DNA測序技術(shù)快速發(fā)展并在分子生態(tài)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用,16S rDNA測序被越來越多的研究人員應(yīng)用于環(huán)境中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析[10-11]。本研究中,我們采集白夾竹遮蔭分株(近端分株,遠(yuǎn)端分株)的根際土壤,對(duì)溶解性有機(jī)碳、微生物生物量、土壤酶活性進(jìn)行測定以研究克隆整合對(duì)異質(zhì)性光照下白夾竹分株根際土壤生物過程的影響;同時(shí),提取根際土壤基因組DNA,進(jìn)行16S rDNA測序來研究分株間資源共享對(duì)異質(zhì)性光照下白夾竹分株根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白夾竹(Phyllostachysbissetii)又稱蓉城竹、四川剛竹,是禾本科(Gramineae)剛竹屬(Phyllostachys)小型竹種,竿高3—6m,粗約2cm,它通過地下根狀莖(竹鞭,rhizome)在水平空間拓展,是典型的克隆植物。產(chǎn)浙江、四川,竿作柄材或篾用,筍食用,同時(shí)是大熊貓的主食竹之一。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)樣地位于四川省邛崍市南寶山鎮(zhèn)(103°14′14″E, 30°14′31″N),海拔1217m,年均溫16.3℃,年降雨量1117.3mm。2015年12月,選擇地勢(shì)較為平緩的白夾竹純林作為實(shí)驗(yàn)處理區(qū)域。選擇分株大小、竹鞭間距一致的白夾竹克隆片段(包含通過竹鞭相連的白夾竹分株),分別標(biāo)記近端分株和遠(yuǎn)端分株。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)包含兩個(gè)處理組：頂向處理組,即克隆片段中遠(yuǎn)端分株處于80%遮蔭狀態(tài),近端分株處于正常光照;基向處理組,即克隆片段中近端分株處于80%遮蔭狀態(tài),遠(yuǎn)端分株處于正常光照。分株間的根狀莖處于割斷或連接處理。實(shí)驗(yàn)過程采取如下處理,以排除外界土壤對(duì)遮蔭分株根際生態(tài)過程的影響：以白夾竹分株竿基部為中心(50cm×50cm)進(jìn)行挖溝,深度50cm,之后對(duì)分株根部土塊周圍包裹聚乙烯膜和PVC板材。聚乙烯膜和PVC板材主要用于防止外部土壤環(huán)境中水分、養(yǎng)分滲入到白夾竹分株根部土塊中。同時(shí),分株根部土塊表面覆蓋遮陽網(wǎng),以防止落葉等凋落物對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。每種實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行10次重復(fù)。上述實(shí)驗(yàn)處理工作于2015年1月中旬全部完成。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Fig.1 Schematic diagram of experiment design

2016年8月12日,采用“抖根法”取得克隆片段內(nèi)進(jìn)行遮蔭處理的白夾竹分株根際土壤[12-13],采集附著于根系表面約4mm以內(nèi)的土壤作為根際土壤,并手工挑出其中的植物殘?bào)w,過篩(<2mm)后儲(chǔ)存于干燥滅菌的自封袋中,并保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.3 土壤理化指標(biāo)測定

根際土壤微生物生物量碳、氮(MBC or MBN)的測定采用氯仿熏蒸法(chloroform-fumigation extraction method with fumigation at atmospheric pressure, CFAP)[14]。用0.5mol/L K2SO4溶液對(duì)進(jìn)行氯仿熏蒸處理以及未進(jìn)行熏蒸處理的根際土壤進(jìn)行浸提,浸提液過濾后通過TOC/TN分析儀(TOC-L analyzer, SHIMADZU, Japan)進(jìn)行溶解性有機(jī)碳(DOC)以及溶解性有機(jī)氮(DON)含量的測定。微生物生物量的計(jì)算通過以下的公式進(jìn)行計(jì)算[15]。

MBC(N)=2.22×EB

式中,EB是進(jìn)行氯仿熏蒸處理與未進(jìn)行熏蒸處理的浸提液溶解性碳、氮含量差值。

N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)活性采用Parham和Deng[16]的方法進(jìn)行測定,NAGase活性表達(dá)為每克鮮土培養(yǎng)1h后釋放的ρ-nitrophenol的微克數(shù);脲酶(Urease)活性的測定根據(jù)Kandeler等[17]的方法,以尿素為底物,脲酶活性表達(dá)為每克干土在37℃下培養(yǎng)2h后每毫升浸提液中水解氮的微克數(shù)。

1.4 土壤樣本高通量測序

采用“GENEOUT土壤DNA提取試劑盒”(LabGene,成都),按照操作說明提取土壤微生物基因組DNA,并進(jìn)行1%凝膠電泳檢測。引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和806R(5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT- 3′)被用來擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3、V4可變區(qū)[18]。PCR反應(yīng)采用20μL反應(yīng)體系：4μL 5× Fast Pfu buffer溶液, 2μL 2.5 mmol/L dNTPs溶液, 0.4μL上游引物(5μmol/L)及0.4μL下游引物 (5μmol/L), 0.4μL Fast Pfu polymerase酶, 以及 10ng 模板DNA,補(bǔ)足ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)退火溫度是55℃。進(jìn)行PCR反應(yīng)的特異性引物需要包含以下特征：1)合適的Illumina接頭序列使得amplicons與流動(dòng)槽(flow cell)連接;2)一個(gè)8bp的標(biāo)簽序列(index sequence),如barcode;3)特異性擴(kuò)增上述目的片段[19]。同時(shí)為滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性以及可靠性,PCR反應(yīng)盡可能采用少的循環(huán)數(shù),并保證每個(gè)樣本擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)一致。

每個(gè)樣品PCR反應(yīng)重復(fù)3次,將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。Amplicons采用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)試劑盒進(jìn)行純化。擴(kuò)增子用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega,USA)進(jìn)行檢測定量,純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等摩爾量混合。PhiX Contral library與Amplicons library進(jìn)行混合,然后在Illumina Miseq platform (Majorbio, Shanghai, China)進(jìn)行雙端測序(paired-end sequence,2×300)。

1.5 數(shù)據(jù)與生物信息分析

采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析根狀莖連接與割斷處理對(duì)遮蔭白夾竹分株根際土壤酶活性、DOC和微生物生物量的影響。數(shù)據(jù)分析以及圖表處理采用SPSS 22 軟件(SPSS, Chicago IL USA) 和Origin Pro 9軟件 (OriginLab Corp., Massachusetts USA)完成。

Miseq原始測序數(shù)據(jù),根據(jù)標(biāo)簽序列將雙端測序序列提取出來,進(jìn)一步的read過濾處理包括：1)剔除引物序列;2)過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基,設(shè)置50bp大小的滑動(dòng)窗口,若窗口內(nèi)平均質(zhì)量低于20從窗口開始截去后端堿基;3)移除小于50bp的truncated reads[20]。經(jīng)過剪切,去除掉存在引物錯(cuò)配、不確定堿基的序列;同時(shí),根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系,將成對(duì)的reads拼接成一條序列,重疊序列的最小長度為10bp;拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2,篩選不符合序列;根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0,最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。經(jīng)過質(zhì)量控制、過濾的Contigs采用QIIME(version 1.17)軟件進(jìn)行后續(xù)剪切、去復(fù)和分類學(xué)歸類。對(duì)于優(yōu)化后的contigs提取非重復(fù)序列,主要為了降低分析中間過程冗余計(jì)算量;去掉沒有重復(fù)的單序列。按照97%的相似性將非重復(fù)序列序列進(jìn)行同源比對(duì)并聚類成可操作分類單元(OTU),聚類過程中通過UCHIME確認(rèn)并剔除序列嵌合體,從而得到OTU代表序列;然后將所有優(yōu)化后的contigs映射到OTU代表序列,選出與OTU代表序列相似性在97%以上的,歸類到相應(yīng)的OTU組別里[21]。然后,與數(shù)據(jù)庫Silva Release119(https://www.arb-silva.de/documentation/release- 119)進(jìn)行比對(duì)(uclust,identity 0.9)。

采用Mothur (v1.12.1)軟件制作稀釋性曲線以確定測序數(shù)據(jù)深度以及合理性,并計(jì)算反應(yīng)菌群多樣性的香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)?；跇颖綩TUs的主成分分析(PCA)由R語言完成,并Vegan 2.0 package作PCA圖。

2 研究結(jié)果

2.1 土壤性質(zhì)

頂向處理組中,根狀莖連接的遮蔭遠(yuǎn)端分株具有比根狀莖切斷遮蔭分株更高的根際土壤DOC、MBC、MBN含量,其中MBC、MBN含量差異顯著(圖2);在基向處理組中,根狀莖連接的近端分株遮蔭后具有比根狀莖割斷處理的遮蔭分株更高的DOC、MBC和MBN含量,差異均達(dá)到顯著水平(圖2)。

圖2 遮蔭分株根際土壤溶解性有機(jī)碳(DOC),微生物生物量碳(MBC),微生物生物量氮(MBN)含量Fig.2 Contents of DOC, MBC, MBN in the rhizosphere soil of shaded distal, proximal ramets差異顯著性依次為** P<0.01, * P<0.05

無論在頂向處理組還是基向處理組中,根狀莖連接的遮蔭分株較根狀莖切斷的遮蔭分株具有更高的NAGase、Urease活性(圖3)。頂向處理組中,根狀莖連接狀態(tài)下的遮蔭遠(yuǎn)端分株根際土壤的NAGase活性顯著高于根狀莖割斷處理的遮蔭遠(yuǎn)端分株,但這種顯著性差異并沒有在基向處理組中觀測到;而對(duì)Urease活性來說,不論是頂向處理還是基向處理,差異均達(dá)到顯著性水平(圖3)。

圖3 遮蔭分株根際土壤胞外酶(NAGase, Urease)活性Fig.3 Extracellular enzyme activities in the rhizosphere soil of shaded ramet

根狀莖連接狀態(tài)、同化產(chǎn)物傳輸方向以及二者交互作用對(duì)遮蔭分株根際土壤特征的雙因素方差分析結(jié)果如表1所示。根狀莖連接狀態(tài)(連接、斷開)對(duì)遮蔭分株根際土壤DOC、微生物生物量、胞外酶活性均產(chǎn)生了顯著性影響;遮蔭分株根際土壤微生物生物量、Urease活性顯著則受到同化產(chǎn)物傳輸方向(頂向、基向)的顯著影響;除Urease活性,根際土壤DOC、微生物生物量、NAGase活性均受到根狀莖連接狀態(tài)、同化產(chǎn)物傳輸方向以及二者交互作用的顯著影響。

表1根狀莖連接狀態(tài)(連接、割斷)、同化產(chǎn)物傳輸方向(頂向、基向)對(duì)遮蔭分株根際土壤特征、土壤胞外酶活性的雙因素方差分析結(jié)果

Table1Resultofsignificancetestforsoilpropertiesandsoilenzymeactivitiesintherhizospheresoilofshaded,distalorproximalramet.Theeffectofrhizomeconnectionstatus(connected or severed),directionofphotosynthatestransport(acropetal transport or basipetal transport)andtheirinteractionweretestedintwo-wayANOVAs

處理 Treatment土壤特征 Soil properties土壤胞外酶活性 Soil extracellular enzyme activitiesDOCMBCMBNNAGaseUrease根狀莖連接狀態(tài) Rhizome connection status32.269??21.281??54.726??35.028??24.291??同化產(chǎn)物傳輸方向Direction of assimilates transport1.86790.613??35.748??0.1340.78??根狀莖連接狀態(tài)×同化產(chǎn)物傳輸方向 Rhizome connection status×Direction of assimilates transport11.248?9.728?11.605??6.698?0.158

表中數(shù)字為F值,顯著性檢驗(yàn)表示為 **P<0.01,*P<0.05; DOC：溶解性有機(jī)碳,dissolved organic carbon; MBC：微生物生物量碳,microbial biomass carbon;MBN：微生物生物量氮,microbial biomass nitrogen

2.2 Illumina Miseq測序分析

通過Illumina Miseq測序,從4個(gè)處理各3個(gè)重復(fù)共12個(gè)土壤樣品中總共得到了556519條序列和18898條可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。樣本的DNA文庫中包含38478到55004個(gè)不等的序列(reads),OTU數(shù)目從1244到1755不等(表2)。稀釋性曲線達(dá)到平臺(tái)期表明測序序列的數(shù)據(jù)量是合理的,意即樣本產(chǎn)生再多數(shù)量的序列也對(duì)最終不同樣本中的OTUs數(shù)目沒有太大貢獻(xiàn)[22]。本研究中的稀釋性曲線表明,根狀莖連接的白夾竹遮蔭近端分株根際土壤(Sample 2)中的OTUs數(shù)量與其余樣品之間存在較大差異;同時(shí)樣品4,8,9,3,11與樣本1,12,5,6,7,10之間OTUs數(shù)目存在微弱差異。但整體來看,所有的樣本的OTUs數(shù)目差距不大(圖4,表2),表明不同根狀莖連接狀態(tài)(割斷,連接)的白夾竹遮蔭分株(遠(yuǎn)端分株,近端分株)根際土壤的OTU數(shù)目并不存在顯著性差異。通過計(jì)算α多樣性指數(shù)(Shannon index),發(fā)現(xiàn)克隆整合對(duì)白夾竹遮蔭分株(遠(yuǎn)端分株,近端分株)根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響并沒有達(dá)到顯著水平。

表2 土壤樣本Miseq測序結(jié)果以及采樣區(qū)域的細(xì)菌多樣性評(píng)估

編號(hào)1—3：土樣來自基向處理組根狀莖連接的遮蔭近端分株;編號(hào)4—6：土樣來自基向處理組根狀莖斷開的遮蔭近端分株;編號(hào)7—9：土樣來自頂向處理組根狀莖連接的遮蔭遠(yuǎn)端分株;編號(hào)10—12：土樣來自頂向處理組根狀莖割斷的遮蔭遠(yuǎn)端分株

圖4 所有樣本基于OTU數(shù)目的稀釋性曲線(97%相似度) Fig.4 Rarefaction curves of the OTU number at 97% similarity for every soil sample

序列比對(duì)結(jié)果表明,所有土壤樣本的OTUs歸屬于13個(gè)門(phylum),419個(gè)屬(genus)(相對(duì)豐度低于1%的菌群歸于others組中)(圖5,圖6,表2)。其中變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)在所有樣品均占據(jù)較大比重。熱孢菌門(Thermotogae)細(xì)菌僅在頂向處理組的白夾竹遮蔭分株根際土壤中被發(fā)現(xiàn),在基向處理組則未發(fā)現(xiàn)。

Xanthobacteraceae(uncultured)包含一屬Azorhizobium,具有共生固氮能力,其在頂向處理組中最大豐度為2.05%,在基向處理組中最大豐度為2.99%(圖5,圖6)。另一種固氮菌屬Bradyrhizobium,相對(duì)豐度最高為3.07%。Nitrosomonadaceae(uncultured)隸屬β-變形菌綱,該科包含的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)以及亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)土壤細(xì)菌調(diào)控著銨鹽向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化的氨氧化過程,是土壤生態(tài)環(huán)境中重要的氨氧化細(xì)菌(AOB)[23]。本研究中,頂向處理組中其相對(duì)豐度從1.17% 到 3.96%,而基向處理組中其相對(duì)豐度較高(2.43%—11.80%)(圖5,圖6)。

在所有的土壤樣品均檢測出了硝化螺菌門(Nitrospirae)的土壤微生物,相對(duì)豐度1.77%—7.83%不等(圖5,表3)。該門僅包含一單科硝化螺菌科(Nitrospiraceae),該科的硝化螺菌屬(Nitrospira)可將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成硝酸鹽,是N素循環(huán)過程中重要的硝化細(xì)菌[24]。頂向處理組中,Nitrospira相對(duì)豐度從0.77%到2.71%,基向處理組中其相對(duì)豐度從1.76%到5.63%不等(圖5,圖6)。Nitrospinaceae(uncultured)在土壤樣品2中發(fā)現(xiàn)(相對(duì)豐度1.41%)(圖6)。Nitrospira和Nitrospinaceae均是重要的亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)[25]。

3 討論

光合產(chǎn)物等物質(zhì)在克隆分株間的運(yùn)輸(頂向、基向傳輸)對(duì)克隆植物生長有著重要生態(tài)意義,特別是處于資源異質(zhì)性斑塊下的克隆植物[26]。已有研究表明,生長在適宜生境斑塊的克隆分株會(huì)傳輸新形成的同化產(chǎn)物給生境條件相對(duì)惡劣斑塊中的分株,以緩解其受到限制的光合能力或養(yǎng)分?jǐn)z取能力[27]。本研究中,根狀莖連接的遮蔭分株根際土壤較高的DOC含量,表明克隆整合提高了白夾竹遮蔭分株根際土壤的C有效性,暗示了白夾竹分株間克隆整合的存在。在樹木環(huán)割實(shí)驗(yàn)中,由于新形成的光合產(chǎn)物向根系的傳輸被打斷,從而削弱了根際沉積[28]。克隆整合對(duì)易分解碳的影響與環(huán)割實(shí)驗(yàn)的影響是相似的,即根狀莖割斷處理的遮蔭分株(遠(yuǎn)端分株,近端分株)根際土壤的DOC以及MBC明顯降低。同樣地,先前的一項(xiàng)匍匐莖草本克隆植物的研究也取得了相似的結(jié)果[29]。

土壤微生物產(chǎn)生的胞外酶(如纖維素酶、木質(zhì)素酶等)能調(diào)控土壤有機(jī)質(zhì)降解、轉(zhuǎn)移和礦化等過程[30]。NAGase參與的殼多糖水解[31],是土壤中有機(jī)碳的重要來源之一[32]。細(xì)菌和真菌均可以產(chǎn)生NAGase[16]。Urease主要由細(xì)菌、絲狀真菌以及酵母菌產(chǎn)生,其在N素礦化過程中起著重要作用[33-34]。因此,相比割斷分株,克隆整合導(dǎo)致的遮蔭分株(遠(yuǎn)端分株,近端分株)根際土壤較高的微生物生物量(MBC、MBN)可能是上述兩種水解酶活性增強(qiáng)的重要原因。同時(shí),根狀莖連接狀態(tài)、同化產(chǎn)物傳輸?shù)姆较蛐詫?duì)土壤胞外酶顯著影響表明克隆整合的方向性對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)降解可能產(chǎn)生不同的影響(表1),個(gè)中機(jī)制則需更多研究證明。

圖7 基于屬水平的土壤細(xì)菌群落組成的主成分分析圖Fig.7 Microbial community composition described by principal component analysis (PCA) based on genus level information

主成分分析(PCA)作為一種對(duì)原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維、簡化、分析的技術(shù),是分析環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)變化的重要手段[35]。基于OTU水平的PCA分析表明,無論是在頂向處理中還是在基向處理中,根狀莖連接處理與割斷處理下的遮蔭分株根際土壤擁有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。先前關(guān)于匍匐莖克隆植物Glechomalongituba生理整合的研究結(jié)果表明,克隆整合顯著改變了遮蔭分株根際土壤微生物群落組成,進(jìn)而促進(jìn)了根際生物過程[25,36]。而我們的研究結(jié)果與之不同。根際土壤C投入將會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)、微生物活性的短期變化[37],而土壤微生物群落種類多、數(shù)量大,土壤生態(tài)系統(tǒng)似乎存在一定程度的功能冗余(redundancy of function),如,微生物多樣性與有機(jī)質(zhì)降解之間并不存在直接的聯(lián)系。某種土壤微生物數(shù)量的削減對(duì)特定的土壤生物過程造成的影響微乎其微,因?yàn)槠渌寥牢⑸锟赡芤矆?zhí)行這種功能[38]。這種功能冗余可能作為一種保障策略(insurance hypothesis),在不穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)中,這些“冗余”物種可能起到維持系統(tǒng)生態(tài)平衡的作用[39]。因此,功能“冗余種”的存在可能使得土壤細(xì)菌群落保持較高的穩(wěn)定性[40-41](resilience of soil microbial community),從而造成土壤細(xì)菌群落對(duì)克隆整合造成的根際土壤C投入響應(yīng)“遲鈍”。這是一種可能性的解釋,而針對(duì)特定細(xì)菌功能群多樣性的研究可能會(huì)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí),相比傳統(tǒng)指紋圖譜(DGGE,PLFA)技術(shù),單個(gè)樣本的高測序通量及各分類水平上的高靈敏度使得高通量測序在環(huán)境微生物研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[42]。雖然,高通量測序在廣度、深度及分辨率上提高了多樣性分析水平,并能夠從整體群落層次上分析微生物遺傳多樣性[43]。但是,高通量測序得到的海量的序列數(shù)據(jù)可能不利于清晰闡釋不同生態(tài)過程下的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異[11],這可能是本研究中克隆整合作用并沒有對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著性影響的另一種解釋。

克隆整合顯著促進(jìn)了白夾竹遮蔭分株(遠(yuǎn)端分株,近端分株)的根際土壤C有效性,進(jìn)而提高了根際微生物生物量。高通量測序能夠較為全面、準(zhǔn)確地反映根際細(xì)菌數(shù)量、活性變化影響的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),并能夠從整體細(xì)菌群落水平反映生物多樣性。海量的序列數(shù)據(jù)可能不利于清晰闡釋不同生態(tài)過程下的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。微生物多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)功能實(shí)現(xiàn)間關(guān)聯(lián)研究的重點(diǎn)在于探討多樣性與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系以及群落結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系[44]。因此,特定功能群(specific functional group)的定量化與高通量測序相結(jié)合,靶定豐度較低但發(fā)揮至關(guān)重要功能的微生物種群,可能為微生物生態(tài)學(xué)的研究提供新的思路。

致謝：感謝四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院劉光立老師、小麥所彭遠(yuǎn)英老師在后期數(shù)據(jù)分析中提供的幫助。

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