劉永亮，丁桂聰

深圳市兒童醫(yī)院口腔科，廣東深圳 518000

三叉神經(jīng)節(jié)（trigeminal ganglion,TG)是三叉神經(jīng)傳導(dǎo)通路的主要初級傳入神經(jīng)元，主要負責頜面部的機械感覺、溫度感覺與痛覺傳導(dǎo)，在頜面部感覺調(diào)控發(fā)揮重要作用[1-2]。

一氧化氮（nitric oxide,NO)雖是短半衰期的自由基分子，但在疼痛傳導(dǎo)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，受到廣泛關(guān)注[3-4]。NO是以左旋精氨酸（L-Arginine）為底物，由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase,NOS）合成。而NOS有3種亞型，包括神經(jīng)元型NOS（constitutive neuronal NOS,nNOS）， 誘導(dǎo)型 NOS（inducible NOS,iNOS）與內(nèi)皮型 NOS（endothelial NOS,eNOS）。nNOS與eNOS又稱為固有型NOS，屬于鈣依賴型，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。iNOS主要存在于巨噬細胞和白細胞，其功能不受胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)，由細胞因子和內(nèi)毒素調(diào)節(jié)[5]。NOS的激活依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phos phate,NADPH），文獻報道NADPH-d與nNOS在相同的細胞群中表達，并且兩者的活性與NO的產(chǎn)生量呈平行關(guān)系。因此，NADPH-d組織化學(xué)染色可作為NOS以及NO生成量的非直接指示因素[6-7]。大量研究認為NO參與頜面部疼痛信號的調(diào)控[8-9]。探究NADPH-d在TG的分布情況對研究NO/NOS系統(tǒng)在頜面部疼痛傳導(dǎo)通路中的作用十分必要。

因此該研究選擇健康雌性大鼠，190～220 g，2015年5月，經(jīng)心灌注固定取雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)，25 μm冰凍切片，采用組織化學(xué)染色方法研究NADPH-d在TG的表達情況。

1 材料與方法

主要實驗試劑：NADPH-d（美國Sigma公司）硝基四唑氮藍（美國Sigma公司）；實驗動物選用健康成年雌性Sprague-Dewley大鼠6只，體重190～220 g，由廣東省實驗動物中心提供；4%多聚甲醛經(jīng)心灌注固定，取 TG 梯度脫水，冰凍切片（25 μm）；NADPH-d組織化學(xué)染色；圖像分析。

2 結(jié)果

NADPH-d在三叉神經(jīng)節(jié)廣泛表達，呈簇狀緊密排列，以中小細胞為主。染色密度與細胞體積相關(guān)，即大體積細胞多數(shù)染色較淡或為陰性，邊界不清晰。而大多中小體積細胞染色較深，見圖1、表1。

圖1 NADPH-d在三叉神經(jīng)節(jié)（TG）神經(jīng)元內(nèi)的表達

圖A,B：NADPH-d組織化學(xué)染色，圖C,D：NADPH-d組織化學(xué)染色灰度照片。黑色/紅色/藍色箭頭代表深染小細胞、中等大小細胞、淺染大細胞。比例尺：100 μm(C),50 μm(D)

表1 NADPH-d陽性細胞體積比例

3 討論

結(jié)果表明NADPH-d在TG廣泛分布，并且中小細胞染色較深，表現(xiàn)更高的NADPH-d活性，而大細胞染色較淺甚至表現(xiàn)為陰性，與Stoyanova等[6]與Fan等[10]在大鼠的檢測結(jié)果及Kolesar[11]等在兔的檢測結(jié)果類似。該次的結(jié)果還補充了中小細胞是主要的NADPH-d陽性細胞，占73.2%。中小體積TG細胞被認為是主要處理傷害性信息的細胞[10]，無論NADPH-d染色深度或數(shù)量占比，中小體積細胞均比大體積細胞突出，這為NONO/NOS系統(tǒng)參與頜面部疼痛調(diào)控提供了形態(tài)學(xué)支持。

除了類似的大鼠生理性形態(tài)研究外，也有一些檢測NO/NOS在病理狀態(tài)下的表達情況，主要集中在三叉神經(jīng)系統(tǒng)初級與二級神經(jīng)元，即三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)中腦核與三叉神經(jīng)脊束核。有研究[7]報道了一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）在 TG、三叉神經(jīng)脊束核尾核及中腦導(dǎo)水管、丘腦等與疼痛相關(guān)核團均有表達，認為NO/NOS系統(tǒng)是偏頭痛的發(fā)病機制之一。Liu等[12]報道了大鼠慢性牙髓炎模型中，NOS陽性神經(jīng)元在TG的表達最早在第3天開始增加，第28天達到峰值。Sugiyama等[13]報道大鼠下牙槽神經(jīng)橫斷可引起機械異常痛覺，并且NO代謝物及NOS陽性細胞在TG表達增加。在TG局部使用NOS選擇性抑制劑可以消除異常痛覺而NOS底物可誘發(fā)異常痛覺。Huang F等[14]報道了在炎性痛的早期TG中、小神經(jīng)元NADPH-d活性增強。這些證據(jù)表明NO/NOS系統(tǒng)參與頜面部疼痛調(diào)控。

然而，需要指出的是盡管以上研究傾向于NO在頜面部疼痛調(diào)控中發(fā)揮致痛作用，較早研究報道在糖尿病誘發(fā)神經(jīng)痛的大鼠中，脊髓背根神經(jīng)節(jié)的NADPH-d陽性細胞與nNOS表達明顯減少，而且胰島素治療可以逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，這提示NO可能起抑痛作用[15]。Hashemi M等[16]在嗎啡鎮(zhèn)痛的大鼠福爾馬林測試中觀察到NO存在鎮(zhèn)痛/抑痛的復(fù)雜作用。研究認為這可能與NO的濃度相關(guān)；不同的傷害形式、持續(xù)時間和強度等激活不同的傳入神經(jīng)對于nNOS的表達起關(guān)鍵性作用，也可能影響NO的疼痛調(diào)控作用[17-18]。

綜上所述，NO/NOS系統(tǒng)在頜面部疼痛中調(diào)控中發(fā)揮重要作用，但當前結(jié)果遠遠不足以闡明其具體機制。至今，NADPH-d陽性細胞在三叉神經(jīng)通路的整體表達尚未明確，尤其是丘腦腹后內(nèi)側(cè)核與大腦皮層等，值得進一步研究；與一些信號因子如降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin-gene-related peptide，CGRP）的關(guān)系也有待深入研究。

[1]Van Buyten JP.Trigeminal Ganglion Stimulation[J].Prog Neurol Surg，2015（29）:76-82.

[2]Durham PL,Garrett FG.Emerging importance of neuronsatellite glia interactions within trigeminal ganglia in craniofacial pain[J].Open Pain J，2010（3）:3-13.

[3]Fan W,Huang F,Wu Z,et al.The role of nitric oxide in orofacial pain.Nitric Oxide，2012，26(1):32-7.

[4]Cury Y,Picolo G,Gutierrez VP，et al.Pain and analgesia:The dual effect of nitric oxide in the nociceptive system[J].2011，25(3):243-254.

[5]Schmidtko A,Tegeder I,Geisslinger G.No NO,no pain The role of nitric oxide and cGMP in spinal pain processing[J].Trends Neurosci，2009，32(6):339-346.

[6]Stoyanova II,Lazarov NE.Localization of nitric oxide synthase in rat trigeminal primary afferent neurons using NADPH-diaphorase histochemistry[J].J Mol Histol，2005，36(3):187-193.

[7]Ramachandran R,Ploug KB,Hay-Schmidt A,et al.Nitric oxide synthase (NOS)in the trigeminal vascular system and other brain structures related to pain in rats[J].Neurosci Lett，2010，484(3):192-196.

[8]Tesser-Viscaíno SA,Denadai-Souza A,Teixeira SA,et al.Putative antinociceptive action of nitric oxide in the caudal part of the spinal trigeminal nucleus during chronic arrageenan-induced arthritis in the rat temporomandibular joint[J].Brain Res，2009，13（2）:85-96.

[9]Kawashima N.Nakano-Kawanishi H.Suzuki N,et al.Effect of NOS inhibitor on cytokine and COX2 expression in rat pulpitis[J].J Dent Res，2005，84(8):762-767.

[10]Fan W,Dong W,Leng S,et al.Expression and colocalization of NADPH-diaphorase and heme oxygenase-2 in trigeminal ganglion and mesencephalic trigeminal nucleus of the rat[J].J Mol Hist,2008,39(4):427-433.

[11]Kolesar D,Kolesarova M,Schreiberova A,et al.Distribution of NADPH diaphorase-exhibiting primary afferent neurons in the trigeminal ganglion and mesencephalic trigeminal nucleus of the rabbit[J].Cell Mol Neurobiol,2006,26(7-8):1265-1279.

[12]Liu Q,Gao Z,Zhu X,et al.Changes in nitric oxide synthase isoforms in the trigeminal ganglion of rat following chronic tooth pulp inflammation[J].Neurosci Lett,2016,633:240-245.

[13]Sugiyama T,Shinoda M,Watase T,et al.Nitric oxide signaling contributes to ectopic orofacial neuropathic pain[J].J Dent Res，2013,92(12):1113-1117.

[14]Huang F,He H,Fan W,et al.Orofacial inflammatory pain affects the expression of MT1R and NADPH-d in rat caudal spinal trigeminal nucleus and trigeminal ganglion[J].Neural Regeneration Research，2013，8(32):2991-3002.

[15]Sasaki T1,Yasuda H,Maeda K,et al.Hyperalgesia and decreased neuronal nitric oxide synthase in diabetic rats[J].Neuroreport，1998，26，9(2):243-247.

[16]Hashemi M,Karami M,Zarrindast MR,et al.Role of nitric oxide in the rat hippocampal CA1 in morphine antino ciception[J].Brain Res，2010，1313:79-88.

[17]Kuan Li,Wen-Xiu Qi.Effects of multiple intrathecal administration of L-arginine with different doses on formalin-induced nociceptive behavioral responses in rats[J].Neurosci Bull，2010，26(3):211-218.

[18]Callsen-Cencic P,Hoheisel U,Kaske A,et al.The controversy about spinal neuronal nitric oxide synthas under which conditions is it up-or downregulated Cell Tissue Res[J].1999,295(2):183-194.