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(1.Department of Ultrasound, 2.Department of Hepatovasculary Surgery, West China Hospital,Sichuan University, Chengdu 610041, China)

門靜脈狹窄(portal vein stenosis, PVS)是肝移植術(shù)后常見血管并發(fā)癥之一?；铙w肝移植中，供體與受體門靜脈管徑不匹配可發(fā)生PVS，嚴重時致門靜脈血流量明顯降低，影響肝再生與功能，甚至導致移植物失功或受體死亡[1-2]。超聲是臨床監(jiān)測PVS的重要手段，狹窄處與狹窄前門靜脈血流速度(portal venous velocity, PVV)比值(PVV ratio， PVVR)是診斷PVS的重要指標之一，PVVR≥4∶1時可考慮PVS[3]。目前少見對肝再生過程中PVVR變化的研究。本研究在大鼠70%肝切除模型基礎(chǔ)上[4]，采用門靜脈部分結(jié)扎法建立不同程度PVS動物模型[5-6]，分析肝臟部分切除后不同程度PVS時PVVR的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康成年雄性SD大鼠102只(購自成都達碩生物科技有限公司)，無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級，7～14周齡，體質(zhì)量200～400 g；實驗前自由飲水及攝食，于23～25℃、12 h光暗周期環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

將SD大鼠隨機分為5組：①對照組(n=6)，僅行剖腹及肝臟游離，不切除肝葉，不結(jié)扎門靜脈；②無PVS組(n=24)，切除70%肝臟，不結(jié)扎門靜脈；③輕度PVS組(n=24)，切除70%肝臟后部分結(jié)扎門靜脈主干，狹窄程度0～50%；④中度PVS組(n=24)，切除70%肝臟后部分結(jié)扎門靜脈主干，狹窄程度>50%～65%；⑤重度PVS組(n=24)，切除70%肝臟后部分結(jié)扎門靜脈主干，狹窄程度>65%～99%。

1.2 動物模型制備

1.2.1 70%肝切除模型制備 將大鼠麻醉后仰臥位保定于實驗臺，參照文獻[4]方法，切除肝中葉及左外葉(約占肝臟總體積68%)，并稱重。

1.2.2 肝切除后不同程度PVS模型制備 切除肝臟后游離門靜脈主干，于門靜脈入肝分支以下、脾靜脈與門靜脈匯合處近心端約2 mm處，以微血管測量尺測量預(yù)結(jié)扎部位門靜脈管徑，根據(jù)擬制作PVS程度計算狹窄處管徑，據(jù)此選取不同型號針頭，用絲線將門靜脈與針頭作為整體一同結(jié)扎，之后快速旋轉(zhuǎn)抽出針頭，此時門靜脈管徑即為針頭外徑，從而建立不同程度PVS。根據(jù)北美癥狀性頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)實驗協(xié)作組(North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial Collaborators， NASCET)標準[7]計算門靜脈狹窄率，即門靜脈狹窄率=(1-狹窄處血管直徑/正常血管直徑)×100%。

1.3 超聲檢查 采用Philips iU22超聲診斷儀，高頻探頭L12-5，頻率5～12 MHz，對無PVS組和輕、中、重度PVS組大鼠于術(shù)后1、3、7、14天分別隨機選取6只行肝臟及門靜脈掃查，采用頻譜多普勒對各PVS組分別測量狹窄處和狹窄前PVV，并計算PVVR：PVVR=狹窄處PVV/狹窄前PVV；對無PVS組測量其PPV。測量時根據(jù)血管走行方向和內(nèi)徑調(diào)節(jié)取樣容積為0.5 mm，在不產(chǎn)生噪音信號前提下將增益調(diào)至最大，矯正聲束與血流之間夾角<60°。均由同一醫(yī)師采用盲法進行掃查，所有結(jié)果測量3次取平均值。

1.4 病理檢查 完成超聲檢查后處死大鼠，切除殘余肝臟并稱重，計算肝再生度(liver regeneration degree, LRD)：LRD=[處死時肝質(zhì)量-(術(shù)前全肝質(zhì)量-切除肝質(zhì)量)]/切除肝質(zhì)量，其中術(shù)前全肝質(zhì)量=切除肝質(zhì)量/0.68[8-9]。

對術(shù)后3天處死的大鼠取體積約為2.0 cm3肝組織，行HE染色并于光鏡下觀察，計算核分裂指數(shù)(mitotic index， MI)。每個切片分別選取中央?yún)^(qū)及周邊區(qū)各4個高倍視野(×400)，觀察并記錄處于核分裂象的細胞數(shù)，計算MI，MI為8個高倍視野中核分裂細胞數(shù)。將對照組大鼠處死，取肝組織，于鏡下觀察有無核分裂。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0和Graphpad Prism 5統(tǒng)計分析軟件，計量資料用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，原始數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，組間存在差異者以LSD法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 病理圖(HE，×400) 切除70%肝臟后無PVS大鼠(A)及輕(B)、中(C)、重度(D)PVS大鼠中央?yún)^(qū)核分裂情況 (箭示處于核分裂的細胞)

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)建模及術(shù)后一般情況 本組成功建立大鼠70%肝臟切除無PVS及輕度、中度、重度PVS模型各24只，后3組門靜脈狹窄率分別為(44.80±5.23)%、(59.3±4.07)%和(69.50±2.17)%。各組大鼠術(shù)后24 h內(nèi)活動、進食少。無PVS組和輕度PVS組大鼠術(shù)后24～48 h內(nèi)進食和活動開始增多，中度、重度PVS組大鼠術(shù)后3～4天進食和活動開始增多。術(shù)后7天，除重度PVS組進食活動稍差外，其余各組大鼠均恢復正常。

2.2 肝再生情況 無PVS組及輕度、中度、重度PVS組術(shù)后3天MI分別為23.67±10.86及11.67±7.76、26.67±9.79、13.67±6.62，各組間總體差異有統(tǒng)計學意義(F=4.096，P=0.020)。無PVS組與中度PVS組MI均高于輕度PVS組(P均<0.05)，重度PVS組MI明顯低于中度PVS組(P<0.05)，見圖1、2；其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。對照組大鼠肝臟未見核分裂象。

無PVS組及輕度、中度、重度PVS組術(shù)后7天LRD分別為0.62±0.24及0.48±0.13、0.55±0.29、0.26±0.09，各組間總體差異有統(tǒng)計學意義(F=3.667，P=0.030)。重度PVS組LRD低于無PVS組和中度PVS組(P均<0.05，圖3)，其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.3 超聲檢查結(jié)果

2.3.1 無PVS組 常規(guī)超聲均清晰顯示大鼠殘余肝臟及門靜脈血流。無PVS組術(shù)后1天PVV較術(shù)前無明顯變化，3天下降至最小，與術(shù)前及術(shù)后1天PVV比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，術(shù)后7、14天逐漸回升，14天時PVV明顯高于3天時(P<0.05，圖4)。

2.3.2 PVS組 常規(guī)灰階超聲均可清晰顯示PVS，多普勒超聲見狹窄處血流紊亂，流速明顯增高，狹窄前流速減慢(圖5)。

各PVS組術(shù)后1、3、7、14天PVVR總體差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。輕度PVS組術(shù)后3天PVVR與1天差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，7天時下降至最小，14天時有所回升；中度及重度PVS組術(shù)后PVVR持續(xù)下降，至7天時降至最小，14天時有所回升(表1)。

術(shù)后1天和3天3組間PVVR總體差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，其中重度PVS組PVVR明顯高于輕度、中度PVS組(P均<0.05)，輕度與中度PVS組間差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；術(shù)后7天和14天各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05，表1)。

表1 各PVS組術(shù)后PVVR變化情況(±s)

表1 各PVS組術(shù)后PVVR變化情況(±s)

組別術(shù)后1天術(shù)后3天術(shù)后7天術(shù)后14天F值P值輕度PVS組4.21±0.784.67±1.421.92±0.51*&2.53±1.00&9.1480.001中度PVS組7.62±3.795.46±2.123.10±1.79*&3.24±2.61*&4.5470.014重度PVS組16.26±9.299.65±3.972.31±1.11*&4.81±1.81*.878<0.001F值10.0394.4082.2951.864——P值0.0020.0310.1190.179——

注：*：與同組術(shù)后1天比較，P<0.05；&：與同組術(shù)后3天比較，P<0.05；#：與同組術(shù)后7天比較，P<0.05

圖2 切除70%肝臟后不同PVS模型大鼠術(shù)后3天MI柱狀圖 圖3 切除70%肝臟后不同PVS模型大鼠術(shù)后7天LRD柱狀圖 圖4 切除70%肝臟后無PVS大鼠不同時間PVV變化柱狀圖

圖5 切除70%肝臟后重度PVS大鼠術(shù)后3天超聲圖像 A.灰階超聲顯示PVS(箭)； B.CDFI示PVS處血流紊亂(箭)； C.頻譜多普勒超聲示狹窄處血流速度明顯加快，PVV為77.3 cm/s； D.頻譜多普勒超聲示狹窄前血流速度明顯減慢，PVV為8.70 cm/s

3 討論

Higgins等[4]建立的大鼠70%肝切除模型是目前研究肝再生的經(jīng)典模型，操作簡單，成模時間短，模型穩(wěn)定，大鼠生存率較高，且便于動態(tài)監(jiān)測血流動力學改變[10]。門靜脈部分結(jié)扎法是制作肝前性門靜脈高壓模型的常用方法[5-6]。本研究在大鼠70%肝切除基礎(chǔ)上結(jié)合門靜脈部分結(jié)扎法，建立不同程度PVS模型。

切除70%肝臟后，大鼠迅速進入肝再生過程，肝再生包括肝實質(zhì)細胞再生和肝組織結(jié)構(gòu)重建。正常情況下，肝實質(zhì)細胞分裂指數(shù)極低(約1/100 000)，肝臟部分切除后即被激活進入細胞分裂周期，術(shù)后1天DNA合成達高峰，3天細胞分裂達高峰，7天時經(jīng)歷1～2次細胞周期，肝臟體積恢復至原有水平[11]。肝組織結(jié)構(gòu)重建主要由以肝血竇內(nèi)皮細胞為主的非實質(zhì)細胞分裂增殖完成，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)對內(nèi)皮細胞生長增殖有促進作用。張文學等[12]發(fā)現(xiàn)VEGF表達在肝切除后12 h逐漸增多，3天達高峰后逐漸下降。本研究無PVS組大鼠肝臟部分切除術(shù)后3天PVV降至最低，7、14天逐漸回升，可能與肝臟部分切除術(shù)后肝細胞增殖狀態(tài)和肝竇血流阻力變化有關(guān)。肝部分切除后肝竇血管床面積減少，血流阻力增加，肝臟處于門靜脈高壓狀態(tài)[13]；術(shù)后3天，細胞分裂和肝血竇重建逐漸達到高峰，血流阻力進一步增大，PVV降至最??；術(shù)后7天隨著肝細胞分裂的完成、肝血竇重建和再生肝臟體積恢復，門靜脈高壓逐漸緩解，PVV逐漸恢復。

不同程度PVS大鼠術(shù)后14天內(nèi)PVVR變化趨勢有所差異，且在術(shù)后1天和3天重度PVS組PVVR明顯高于輕、中度組，而術(shù)后7天和14天不同程度PVS組間PVVR無明顯差異，其可能影響因素如下：①PVS程度直接影響PVV和PVVR；②不同程度PVS對肝再生的影響不同，使肝細胞分裂及血竇重建水平和速度出現(xiàn)不同程度增高或降低，從而對血流阻力產(chǎn)生相應(yīng)影響。本研究術(shù)后3天中度PVS組MI明顯高于輕度和重度PVS組，提示中度PVS時，門靜脈血流量減少對肝臟造成的損傷在一定范圍內(nèi)與肝再生狀態(tài)呈負相關(guān)[14]，使得肝再生較輕度PVS更為活躍，肝細胞分裂及血竇重建水平更高，血流阻力增大可能更加明顯；而術(shù)后7天重度PVS LRD明顯減低，提示入肝血流量明顯減少抑制了肝再生進展，使得血流阻力受到相應(yīng)影響；③肝再生過程中不同程度PVS門靜脈血流量變化對流速及比值也有一定影響。

綜上所述，超聲可準確監(jiān)測大鼠部分肝切除后PVS血流改變；不同程度PVS大鼠PVVR在肝再生過程中的變化各不相同；隨大鼠肝再生進展，PVVR變化除受狹窄程度影響外，還可能與肝細胞病理改變、核分裂狀態(tài)、再生肝臟體積等因素有關(guān)，尚需進一步研究。

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