吳明皇，林 玲，孫承文，王英英，石存斌*(.平陽(yáng)縣漁業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 溫州 35400； .中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 50385)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗稱石蛙、石雞，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。上世紀(jì)80年代開(kāi)始人工馴養(yǎng)，隨著人工繁殖技術(shù)的日漸成熟[1-3]，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，再加上養(yǎng)殖密度的提高、養(yǎng)殖管理和疾病防治措施等方面存在不足，導(dǎo)致棘胸蛙的病害也相繼增多，如爛皮病、嗜水氣單胞菌病、歪頭病、白內(nèi)障等[4-10]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2013年開(kāi)始，溫州市蒼南地區(qū)棘胸蛙流行一種以“白內(nèi)障”為主要特征的疾病，臨床癥狀表現(xiàn)為病蛙眼睛白濁、頭部歪斜、厭食。該病傳染性強(qiáng)、死亡率高，使用多種藥物效果都不明顯，對(duì)養(yǎng)殖戶帶來(lái)極大的損失。根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，引起蛙“白內(nèi)障”的病原有：金黃色葡萄球菌、氣單胞菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、布氏檸檬酸桿菌、腦膜炎敗血金黃桿菌(腦膜敗血伊麗莎白菌)等[10-15]，由于引起“白內(nèi)障”的病原菌種類多樣，為了解決這一問(wèn)題，筆者對(duì)棘胸蛙“白內(nèi)障”病原進(jìn)行了分離鑒定，人工感染試驗(yàn)確定病原菌，并進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，以期為該病的診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病棘胸蛙取自蒼南縣赤溪鎮(zhèn)鳳陽(yáng)社區(qū)棘胸蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，50～300 g大小不等，眼球白濁，部分頭部歪斜，在水面上打轉(zhuǎn)。健康棘胸蛙由蒼南縣藻溪鎮(zhèn)石蛙養(yǎng)殖場(chǎng)提供，體重50～100 g，該養(yǎng)殖場(chǎng)沒(méi)有發(fā)生過(guò)此類疾病。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自上海銘博生物科技有限公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)(Axygen)生物科技有限公司；PCR有關(guān)試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司；ATB細(xì)菌鑒定條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。其他常規(guī)試劑由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 細(xì)菌的分離

取“白內(nèi)障”病狀的棘胸蛙，按照常規(guī)無(wú)菌操作方法，用75%酒精進(jìn)行體表消毒，用接種環(huán)從腦、肝臟中取組織接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落劃線分離，進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化后菌落用于人工感染和鑒定試驗(yàn)。

1.3 人工感染試驗(yàn)

將純化后的分離菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，用生理鹽水稀釋成3×108mL-1菌懸液，采用大腿注射法進(jìn)行人工感染，每只蛙注射0.2 mL菌懸液，對(duì)照組注射0.2 mL生理鹽水。感染后分別飼養(yǎng)在塑料水族箱中，進(jìn)行日常管理，試驗(yàn)期間水溫20～25 ℃，每日觀察、記錄發(fā)病和死亡情況，并進(jìn)行病原再分離。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

1.4.2 細(xì)菌生理生化鑒定

生理生化特性測(cè)定參照ID 32 E(法國(guó)生物梅里埃公司)生化鑒定條說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列分析

用基因組提取試劑盒提取細(xì)菌的全基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增上游引物8F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，下游引物1492R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性5 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在NCBI中用BLAST進(jìn)行同源性比較。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法。將病原菌劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，培養(yǎng)18 h后用生理鹽水洗下菌苔，再用生理鹽水稀釋為0.5 倍麥?zhǔn)蠞舛群螅妹奘米诱喝【壕鶆蛲坎寂囵B(yǎng)基表面，然后用鑷子將藥敏紙片貼在瓊脂平板表面，控制好紙片間的間距，28 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h 后測(cè)量抑菌圈大小，并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 患病棘胸蛙主要癥狀

病蛙最為明顯的癥狀是兩個(gè)眼球變白(類似白內(nèi)障，圖1)，有些出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)機(jī)能失調(diào)，在水面上打轉(zhuǎn)。

圖1 患病棘胸蛙眼部特征觀察

2.2 人工感染

肌肉注射感染健康棘胸蛙7 d后，試驗(yàn)組10只蛙全部出現(xiàn)白內(nèi)障癥狀并開(kāi)始死亡，15 d后試驗(yàn)組死亡率100%(表1)，與自然發(fā)病癥狀基本相同。對(duì)照組全部存活。從人工感染的棘胸蛙腦部和肝臟分離得到與PY-SW1506特征一致的菌株，說(shuō)明分離菌株對(duì)棘胸蛙具有較強(qiáng)的致病力。

表1 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離鑒定

2.3.1 病原形態(tài)特征

從肝臟和腦組織分離的兩株菌，形態(tài)大小一致，革蘭氏染色觀察為陰性短桿菌(圖2)，在培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，微凸，呈微黃色。

2.3.2 生理生化鑒定

根據(jù)表2病原菌的生理生化特征，經(jīng)過(guò)全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定為腦膜敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningosepticum)。

圖2 經(jīng)革蘭氏染色后的細(xì)菌形態(tài)(×1 000)

表2 分離病菌的生理生化鑒定結(jié)果

2.3.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列

PCR擴(kuò)增病原菌的16S rRNA基因片段大約為1 418 bp，對(duì)序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，與GenBank上收錄的腦膜敗血伊麗莎白菌(GenBank：HQ154560.1)和腦膜炎敗血金黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum)(GenBank：AY468482.1)菌株有99%同源性，因此鑒定該菌株為腦膜敗血伊麗莎白菌。

2.4 藥物敏感性

測(cè)定了致病菌對(duì)26種藥物的敏感性(表3)， 結(jié)果顯示對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、萬(wàn)古霉素、多西環(huán)素、利福平等7種藥物高度敏感，對(duì)鏈霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢西叮等4種藥物中度敏感，對(duì)氨芐西林、青霉素、頭孢唑林等15種藥物表現(xiàn)為耐藥性。

表3 致病菌對(duì)26種藥物的敏感性

注:S表示敏感；I表示中度敏感；R表示耐藥。

3 討論

本文對(duì)患“白內(nèi)障”的棘胸蛙進(jìn)行細(xì)菌分離，將分離得到的細(xì)菌對(duì)健康棘胸蛙進(jìn)行了攻毒感染試驗(yàn)，并通過(guò)生理生化和16S rRNA基因序列分析確定了棘胸蛙“白內(nèi)障”的病原是腦膜敗血伊麗莎白菌。

腦膜敗血伊麗莎白菌，曾稱腦膜炎敗血金黃桿菌、腦膜炎敗血黃桿菌，屬于黃桿菌綱，黃桿菌目，黃桿菌科，伊麗莎白菌屬，廣泛存在于自然環(huán)境中，該菌能引起新生兒暴發(fā)性腦膜炎、敗血癥等[16-17]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，對(duì)蛙、鱉、黃鱔等多種水生動(dòng)物具有較強(qiáng)的致病性[18-20]，它能通過(guò)血腦屏障直接侵入大腦，張奇亞等[21]對(duì)患旋游癥美國(guó)青蛙進(jìn)行病理組織切片觀察，認(rèn)為腦膜炎敗血金黃桿菌引起腦組織受損，腦功能障礙，視覺(jué)功能減弱或逐漸喪失，這也是為什么由腦膜敗血伊麗莎白菌引起的“白內(nèi)障”病蛙通常伴隨著頭部歪斜、狂游、身體失去平衡或浮于水面打轉(zhuǎn)等癥狀的主要原因。

藥敏試驗(yàn)表明，腦膜敗血伊麗莎白菌具有較強(qiáng)的耐藥性，試驗(yàn)中致病菌對(duì)26種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，僅恩諾沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、萬(wàn)古霉素、多西環(huán)素、利福平等7種抗菌藥物對(duì)該菌有較好的抗菌作用。但是在生產(chǎn)上，我們分別使用了強(qiáng)力霉素和恩諾沙星來(lái)治療，效果均不明顯，可能的因素：1)由于這些藥物難以通過(guò)血腦屏障深入到大腦和眼部；2)腦組織和視覺(jué)神經(jīng)損傷的不可逆性，視覺(jué)不能完全康復(fù)，導(dǎo)致病蛙尋找不到食物，最終還是因?yàn)轲囸I而死。這也可能是腦膜敗血伊麗莎白菌危害極大并難以治療的原因。

腦膜敗血伊麗莎白菌是致病力強(qiáng)、耐藥性強(qiáng)的病菌，養(yǎng)殖戶應(yīng)高度重視，在生產(chǎn)上更應(yīng)以防為主，主要控制好養(yǎng)殖環(huán)境和增強(qiáng)體質(zhì)，食用優(yōu)質(zhì)餌料和接種疫苗提高抗病力[22]。對(duì)蛙、水體、餌料及生產(chǎn)用具進(jìn)行定期或不定期的消毒，一旦發(fā)現(xiàn)病蛙應(yīng)及時(shí)清理，以免交叉感染。

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