沈 揚,于 暢,孔東東,王榮芳,李 劍 (北京師范大學水科學研究院,北京師范大學地下水污染控制與修復教育部工程中心,北京 100875)

甲狀腺激素由甲狀腺分泌,在人類和動物的生理過程中發(fā)揮著重要的作用,包括調節(jié)生長、能量代謝、組織分化和發(fā)育以及維護大腦功能等[1].甲狀腺激素干擾物(TDCs)是一類能改變下丘腦-垂體-甲狀腺軸穩(wěn)態(tài)的維持和調節(jié)或者作用于依賴于甲狀腺激素的相關功能的一類外源性化合物[2].甲狀腺激素功能的紊亂可導致兒童大腦的發(fā)育和神經系統(tǒng)的發(fā)育障礙[3-4].

目前許多外源性化合物能夠干擾甲狀腺激素活性,已發(fā)現(xiàn)的可疑甲狀腺激素干擾物包括:多氯聯(lián)苯類(PCBs)、二噁英類物質、溴代阻燃劑類(BFRs,如多溴聯(lián)苯類(PBBs),多溴聯(lián)苯醚(PBDEs))、有機磷阻燃劑類(OPFRs)、鄰苯二甲酸酯類(PAEs)等[4-5].其中,OPFRs由于其優(yōu)良的阻燃性能,成為 BFRs的替代產品,目前已廣泛應用于紡織、化工、建材以及電子等行業(yè)[6].隨著BFRs在世界范圍逐步禁用, OPFRs目前的全球年產量已達 20萬 t[7].其中,磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)是目前最常見的有機磷阻燃劑.TCPP的大量生產和使用導致其在環(huán)境和人體組織中的廣泛檢出. Khan等[8]在巴基斯坦的工業(yè)區(qū)和農村的飲用水中檢出 TCPP是主要的阻燃劑類污染物.2014年,在我國黃海、東海海域廣泛檢出TCPP,檢出濃度范圍為 92～1392ng/L.TCPP甚至在南京飲用水中被檢出,濃度為 325ng/L[9].TCPP在環(huán)境中的廣泛檢出可能對人體健康和生態(tài)安全構成威脅[10].例如,TCPP會干擾內分泌系統(tǒng),影響斑馬魚的正常發(fā)育[11].

TCPP在分子結構方面與天然甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)結構類似,可能模擬天然甲狀腺激素對生物體產生干擾.TCPP已被列入可疑TDCs清單,因此TCPP可能對甲狀腺激素產生干擾效應.陸美婭等[12]采用報告基因檢測方法考察9種OPFRs與甲狀腺激素受體(TR)的作用,結果表明 TCPP表現(xiàn)出顯著的TR抑制活性.但是,Kojima等[13]開展TCPP與甲狀腺核受體 TRα、TRβ的作用研究發(fā)現(xiàn),未檢出其對 TRα/β誘導或抑制活性.可見,對于TCPP甲狀腺激素毒性,目前的研究報道并沒有得到一致性的結論.綜上所述,TCPP甲狀腺激素干擾毒性及其致毒機理的研究才剛剛起步,急需開展 TCPP的甲狀腺激素干擾活性及其作用機理的相關研究.

由于 TCPP可能模擬天然甲狀腺激素干擾其活性,關于 TCPP對甲狀腺激素干擾作用機理的研究通常以甲狀腺激素的分子作用機制研究為基礎.目前的研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺激素主要通過基因組作用和非基因組作用兩種途徑在不同的組織中行使生理功能[14].目前的研究多集中于基因組作用途徑,即經典核受體途徑.近年來的研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺激素還可以通過非基因轉錄的方式對靶細胞或組織進行調節(jié),即存在非基因組(nongenomic)途徑.甲狀腺激素的非基因組作用可以定義為 THs與細胞核外的受體不通過核內結合過程所產生的作用[15].此前,有文獻[16-17]證實PCB153可通過非基因組作用途徑產生甲狀腺激素干擾效應,進一步佐證了非基因組作用途徑是TDCs的甲狀腺激素干擾效應的重要因素.但是目前關于 TDCs對甲狀腺激素的非基因組作用途徑的研究報道較少.

本文選擇典型的OPFRs TCPP作為研究對象,通過對GH3細胞增殖實驗和重組TR基因酵母實驗考察其甲狀腺激素干擾效應,同時采用實時定量PCR技術,表征TCPP暴露對GH3細胞關鍵基因表達的調節(jié),初步探明其干擾作用機理.以期為TCPP的甲狀腺激素毒性及TCPP環(huán)境風險評價提供基礎數(shù)據和理論支持;同時,本研究可為其他 TDCs的甲狀腺激素干擾機理的研究提供方法學上的借鑒.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

F10培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、15%馬血清均購自Gibco公司(美國);胰蛋白酶購自 Life Technologies公司(美國);牛胰島素(≥95%)、牛血清白蛋白(98%)購自 Sigma公司(美國);人脫鐵轉鐵蛋白(98%)購自 Solarbio公司;乙醇胺(99.5%),亞硒酸鈉(99.75%),TCPP(99%),T3(98%,購自上海百靈威化學公司);MTT試劑盒和LDH試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.二甲亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)(99.5%)購自Sigma-Aldrich公司(美國).

1.2 重組TR基因酵母實驗

重組TR基因酵母由中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室提供.測試方法參考文獻[18]進行.可簡述為,選擇指數(shù)生長期的酵母,調節(jié)酵母菌株培養(yǎng)液在600nm波長處的吸光度值為0.8左右.在無菌條件下取995μL菌株培養(yǎng)液、5μL DMSO 溶解的樣品,混勻成暴露培養(yǎng)液.DMSO作為陰性對照,T3作為陽性對照.將200μL暴露培養(yǎng)液加入無菌的 96孔培養(yǎng)板中,800r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)2h.酶標儀(TECAN GENios A-5002, Austria)測定 OD600的值.從培養(yǎng)板中吸出150μL菌液,加入120μL緩沖液,在微孔搖床上預培養(yǎng)5min后加入20μL三氯甲烷,微孔搖床最大轉速振蕩 10min破碎酵母細胞;再加入40μL o-NPG 反應液啟動酶反應,并計時直至出現(xiàn)明顯的黃色,反應完成后加入 100μL (1mol/L)的碳酸鈉溶液,固定反應,吸取200μL轉移到酶標板中測定420nm波長處的吸光度值,計算目標化合物誘導酶活性值如文獻[18]所述.對目標化合物的 TR抑制活性開展檢測時,在測試體系中添加5×10-6mol/L T3,檢測目標化合物對T3誘導酶活性的抑制作用,每個樣品設 4組平行,參考文獻[19]報道計算目標化合物的抑制率.

1.3 細胞增殖實驗

GH3大鼠垂體瘤細胞株引自中國醫(yī)學科學院基礎所細胞中心,GH3(TRβ-)細胞由英茂盛業(yè)生物科技有限公司提供,其原理可簡述為:根據TRβ1mRNA序列設計6個靶點和一個陰性隨機對照序列,構建慢病毒 TRβ1RNA 干擾載體和陰性對照載體.將慢病毒 TRβ1RNA 干擾載體和陰性對照載體分別包裝為慢病毒后感染GH3細胞,通過嘌呤霉素(puromycin)篩選 TRβ1基因 RNA干擾穩(wěn)定細胞株,驗證結果表明 GH3(TRβ-)細胞株TRβ1的相對表達量為空白對照的17.95%,可認為 TRβ1缺陷細胞.GH3細胞和 GH3(TRβ-)細胞的培養(yǎng)方式細胞增殖實驗步驟相同,參考文獻[20],可簡述為:用F10培養(yǎng)基(含2.5%胎牛血清、15%馬血清)37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3～4天傳代 1次.取對數(shù)生長期的細胞,經 0.25%胰蛋白酶消化后,用貼壁培養(yǎng)基(1mg 牛胰島素,0.6μL 乙醇胺(1μmol/L),1μg亞硒酸鈉,1mg人輔基轉鐵蛋白及 50mg牛血清白蛋白定容于100mL DMEM/F12培養(yǎng)基)調整細胞密度為4×l05個/mL.每孔加入 100μL 細胞懸液,8μL 目標化合物加入到4mL培養(yǎng)基中制備暴露培養(yǎng)液,待24h細胞貼壁后,加入暴露培養(yǎng)液20μL,DMSO作為空白對照,保證每孔 DMSO終濃度為 0.1%.繼續(xù)培養(yǎng)48h后,每孔加入20μL的MTT溶液,培養(yǎng)箱中孵化 4h后吸盡所有溶液,加入 150μL/孔DMSO,置于搖床上振搖 10min后,酶標儀測定570nm 下的吸光度值 OD570.樣品(Iai)和對照(IT3)的細胞增殖率的計算參考文獻[18]報道進行.細胞增殖抑制率Ibi計算公式如下.

式中:Ibi為細胞增殖抑制率;IT3為T3的細胞增殖率;Iai為樣品誘導的細胞增殖率.

1.4 乳酸脫氫酶(LDH)檢測方法

為排除目標化合物急性細胞毒性對測試結果的影響,重組基因酵母實驗參考文獻[18]報道方法檢測目標化合物對酵母細胞的急性毒性.

LDH實驗補充檢測化合物暴露后誘導細胞產生的乳酸脫氫酶,以表征目標化合物對GH3細胞的急性毒性.測試流程可簡述為:細胞增殖實驗在加入 MTT溶液之前,從對應的培養(yǎng)板中取上清液100μL加入新的96孔板中,置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10min,根據LDH試劑盒的說明書進行檢測.酶標儀于440nm波長處測定吸光度值,

式中:Ui為LDH露出率;ODd為目標化合物的吸光度值;ODc為對照的吸光度值;ODt為標準品的吸光度值;ODb為空白樣品的吸光度值;C為標準品濃度2mmol/L;D為稀釋倍數(shù);Ri為LDH相對露出率;Uii為目標化合物的 LDH露出率;Uio為DMSO的LDH露出率.Uii和Uio均由式(2)計算得到.

1.5 RT-PCR法檢測目的基因mRNA表達[21]

1.5.1 RNA提取方法與逆轉錄 GH3細胞暴露TCPP與細胞增殖實驗前期步驟相同,暴露完成后,使用RNA-Solv reagent試劑盒(Omega公司,美國)并按照其步驟提取總 RNA.通過測定樣品在A260nm/A280nm的比值確定樣品的純度在1.8到2.0的范圍內(Nanodrop ND-1000, Nano-Drop,Wilmington, USA).使用 PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Takara公司,日本)逆轉錄,具體操作方法參見試劑盒的說明書.

1.5.2 熒光定量PCR方法 使用ABI7500Realtime PCR System對目標基因進行SYBR Green絕對定量PCR反應,每個樣品設4組平行.在無菌96孔板中配置20μL PCR反應體系.SYBR Green溶液10μL;前引物、后引物各1μL;DNA樣品＜1μg;無菌水補齊20μL.反應過程為:95℃下變性5min,之后進行40個循環(huán),每個循環(huán)在95℃下15s,退火溫度55℃1min.以 β-actin為內參照.各目的基因及內參基因β-actin的引物見表1.采用比較循環(huán)閾值法分析各組中mRNA的相對表達量.

表1 實時定量PCR引物Table 1 Primer sequence for quantitative Real-time PCR in GH3cell

1.6 數(shù)據處理與分析

所有實驗數(shù)據均采用Excel軟件進行統(tǒng)計處理.所得數(shù)據以±s表示,組間差異采用 t檢驗.P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果與討論

2.1 TCPP對GH3細胞增殖的影響

TCPP 暴露濃度范圍設定為 2×10-8～2×10-4(mol/L),檢測不同暴露濃度下 TCPP對甲狀腺激素效應的干擾.測試結果如圖1(a)所示, TCPP與空白對照相比對GH3細胞無顯著的增殖促進作用(P＞0.05).

圖1 TCPP對GH3細胞增殖的影響Fig.1 Effect of different treatment concentrations on GH3 proliferation of TCPP

為表征 TCPP對 T3增殖活性的抑制,將TCPP與T3(2×10-8mol/L)共同暴露,考察TCPP對GH3細胞增殖的影響.結果如圖 1(b)所示,TCPP在 1×10-4mol/L和2×10-4mol/L暴露濃度下抑制率分別達到24.47%和34.43%,對T3的增殖具有明顯的抑制作用(P＜0.01).GH3細胞富含 TR,具有甲狀腺激素依賴增殖的特點,通過檢測化合物暴露對GH3細胞增殖的影響發(fā)展了該方法,已成為TDCs篩選的主要方法,廣泛應用于PCBs等甲狀腺激素干擾效應的檢測[22].本實驗的結果表明,TCPP對于GH3細胞無明顯的細胞增殖誘導效應.但是,TCPP能夠抑制天然甲狀腺激素T3對GH3細胞的增殖效應,表現(xiàn)出GH3細胞增殖抑制活性.說明TCPP可干擾甲狀腺激素效應,表現(xiàn)為甲狀腺激素的抑制劑.

為排除目標化合物的急性毒性對實驗結果的影響,添加 LDH 檢測實驗.其測試原理可表征為:化合物暴露導致細胞損傷,受損細胞在培養(yǎng)過程中破碎并釋放LDH,因此通過檢測細胞培養(yǎng)液中LDH露出率的高低反映暴露化合物的急性毒性[23].TCPP 暴露 GH3細胞后,通過檢測培養(yǎng)液中的LDH活性變化,表征TCPP對GH3細胞的急性毒性.測試結果如圖 2所示,所有暴露濃度下,TCPP對GH3細胞的LDH露出率與空白對照相比無顯著變化(P＞0.01),表明測試濃度下,TCPP未對GH3細胞產生顯著損傷.該實驗結果基本排除 TCPP產生細胞毒性對細胞增殖的影響,表明TCPP對 T3誘導的 GH3細胞增殖具有抑制活性,TCPP具有甲狀腺激素干擾效應.

圖2 TCPP染毒對GH3細胞LDH露出率的影響Fig.2 LDH leakage rate of GH3cells exposure to TCPP

2.2 TCPP甲狀腺激素干擾途徑初步研究

2.2.1 TCPP對重組TR基因酵母的甲狀腺激素干擾效應 為了考察 TCPP對 TR的干擾作用,選擇暴露濃度為 2×10-8～2×10-4(mol/L)開展重組TR基因酵母實驗,測試結果表明,所有樣品均未檢出顯著的酵母細胞急性毒性,表明了 TCPP即使在最高暴露濃度下也不會誘導酵母細胞損傷,排除了待測化合物急性毒性對酵母細胞甲狀腺激素干擾效應測試結果的影響.

如圖3(a)所示,對比各濃度下TCPP與T3的誘導率(100.50%)可知,TCPP未表現(xiàn)出明顯的TR誘導活性.低濃度下,TCPP未表現(xiàn)出顯著的TR抑制活性;高濃度(＞2×10-5mol/L)情況下,TCPP 表現(xiàn)出顯著的TR抑制效應(P＜0.05),在TCPP的暴露濃度為 2×10-4mol/L 時,誘導率達到 36.09%(P＜0.01)(圖 3(b)).陸美婭等[12]采用報告基因檢測方法考察 TCPP等的甲狀腺激素干擾效應,結果表明 TCPP 在(1×10-9mol/L～1×10-5mol/L)濃度范圍內無TR誘導活性,而在1×10-5mol/L濃度下表現(xiàn)出 TR抑制活性,與本文的研究結論基本一致.該結果與上文報道的GH3細胞增殖實驗的結果也具有一致性,均未檢測出顯著的 TCPP甲狀腺激素誘導活性,但是檢測出 TCPP甲狀腺激素抑制活性.重組 TR基因酵母方法實驗的實驗原理可簡述為采用酵母雙雜交技術將TR基因和受體共激活因子基因共轉化進入酵母細胞,通過測定報告基因 LacZ表達產物 β-半乳糖苷酶活性,表征化合物對 TR的干擾活性[24].結合本文的實驗結果,可初步表明TCPP可通過TR途徑實現(xiàn)對甲狀腺激素活性的干擾.大量文獻報道典型的 TDCs,例如PCBs、PBDEs和PBBs[25-26],均可通過作用TR,實現(xiàn)對甲狀腺激素活性的干擾.

2.2.2 TCPP對 GH3(TRβ-)細胞增殖的影響 近年來有研究表明,甲狀腺激素不僅可以通過 TR對靶細胞進行作用,還可以通過非基因轉錄的方式對靶細胞或組織進行調節(jié),即存在非基因組途徑.已有研究表明在 TR眾多亞型中,甲狀腺激素主要通過TRβ對靶細胞進行作用[27].因此,本研究采用基因沉默技術敲除 GH3細胞中的TRβ 基因,構建 GH3(TRβ-)缺陷型細胞,并通過GH3(TRβ-)細胞增殖實驗,考察 TCPP是否通過非基因組途徑干擾甲狀腺激素效應.本文重點考察 TCPP對 GH3(TRβ-)細胞增殖的抑制效應.TCPP和T3共同暴露于GH3(TRβ-)細胞,結果表明,TCPP的暴露濃度在 1×10-4mol/L 和 2×10-4mol/L時,細胞增殖率分別為 113.39%和109.23%,顯著低于T3單獨作用下的細胞增殖率(P＜0.05),表明 TCPP 對 T3 誘導的 GH3(TRβ-)細胞增殖具有抑制活性.

本文的實驗結果表明,TCPP在暴露濃度為1×10-4mol/L和2×10-4mol/L時可抑制T3誘導的GH3(TRβ-)細胞增殖,表明TCPP可能存在TR途徑外的作用方式.Liu等[16]的報道也證實PCB153可通過刺激氨基末端激酶(JNK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路下調甲狀腺激素水平,證實 PCB153可通過非基因組作用產生甲狀腺激素干擾效應.進一步佐證了非基因組作用途徑不僅存在于 THs 調節(jié)的生物學效應,同時也是TDCs甲狀腺激素干擾效應的重要作用方式.此前的研究表明非基因組途徑不依賴基因轉錄和翻譯、能夠在數(shù)秒或分鐘時間內快速應答,對維持THs的生物學效應起著至關重要的作用[15].因此,研究 TDCs的甲狀腺激素干擾非基因組效應的作用機理具有重要的環(huán)境意義,其對于更加全面的評估 TDCs的毒理學效應,從而預測造成的生態(tài)與健康風險.由此可見,研究TDCs不應僅僅局限于對基因組作用途徑的考察,應拓展 TDCs作用途徑的研究.

圖4 TCPP對GH3(TRβ-)細胞的抑制效應Fig.4 Antagonist activities of TCPP using the GH3(TRβ-)cell proliferation assay

2.3 TCPP對相關mRNA表達的影響

為探究TCPP的甲狀腺激素干擾效應及可能的作用途徑,在基因層面上,考察 TCPP暴露對相關基因mRNA表達的調節(jié).測試結果如圖5所示,TCPP與T3共同暴露GH3細胞48h后, c-fos基因、TRβ基因, integrin-av基因和k-ras基因mRNA表達顯著下調;TRα基因、raf-1基因和Mapk-3基因mRNA表達與對照組相比無顯著變化.

已有研究證明 TDCs能夠在不同的組織干擾TRα、TRβ mRNA的表達[26].此外,Scarlett等[29]通過對人類成骨細胞對甲狀腺激素信號通路的研究,結果表明甲狀腺激素能通過結合細胞膜整合素 αvβ3能夠迅速激活 ERK-1/2活性.ERK1/2是一條重要的調節(jié)細胞增殖分化和凋亡的信號轉導通路,其主要受各種生長因子或外來化合物等磷酸化而激活[30].ERK1/2的活化是信號從細胞膜表面轉導至核內的關鍵,這一轉導過程包括k-ras、raf-1、Mapk-3等基因的參與.

已有研究表明,c-fos基因是一個與細胞增殖相關的原癌基因,可調控細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡,誘導細胞轉化和腫瘤形成[31].GH3細胞增殖實驗表明TCPP可抑制T3誘導的細胞增殖效應,c-fos表達的下調與此結果相符合,提示TCPP可能通過下調c-fos抑制細胞增殖.

如圖5所示,TCPP暴露可導致TRβ mRNA表達顯著下調.Augustine等報道了與本文類似的結論,證實典型 TDCs可以通過干擾 TRβmRNA的表達干擾甲狀腺激素活性.p,p,-DDE在0.01mg/kg暴露青蛙后,檢測到腎臟中 TRβ基因表達下調[32].Shi等[33]研究也表明全氟辛烷磺酸暴露導致斑馬魚幼魚 TRβ表達下調.THs與 TR結合通過受體級聯(lián)反應實現(xiàn)對相關基因表達的調控,而TDCs通過調節(jié)TRβ基因表達,可能導致THs不能激活受體級聯(lián)反應[34],從而影響細胞增殖等激素調節(jié)過程.基于此,可初步認為TCPP可能通過影響 TRβ基因表達,干擾激素-受體級聯(lián)反應,產生甲狀腺激素干擾效應.

圖5 TCPP與T3(2×10-8mol/L)共同暴露GH3細胞對相關基因mRNA表達水平的調節(jié)Fig.5 mRNA levels of related gene in GH3cell** P＜0.01

αvβ3-ERK-1/2轉導過程包括 integrin-av、k-ras和 raf-1等基因的參與[30].本研究中,integrin-av和k-ras基因的mRNA顯著下調,說明 TCPP可能激活 αvβ3-ERK-1/2通路.已有文獻[35]報道典型 TDCs 鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)染毒大鼠睪丸支持細胞后致使ERK通路相關基因表達顯著降低.相關理論研究表明,αvβ3-ERK-1/2信號通路在細胞的分裂、遷移及存活方面有重要的調節(jié)作用,主要參與各種生長因子、細胞因子、絲裂原以及激素受體活化后的信號轉導,參與細胞的生存、增殖[36].初步表明TCPP可通過αvβ3-ERK-1/2信號通路,即通過非基因組作用途徑,調節(jié)細胞增殖,與本文 2.2.2研究結果一致.此外,有研究表明[15],非基因組途徑可能和基因組途徑產生協(xié)同效應.以 αvβ3-ERK1/2 信號通路為例, ERK1/2亦可進入細胞核內,通過磷酸化激活 TR,直接作用于甲狀腺激素反應基因.因此,TCPP也可能兩種作用途徑的整合干擾甲狀腺激素調節(jié)的快速及長期效應.

3 結論

3.1 GH3細胞增殖實驗表明TCPP可對甲狀腺激素產生干擾效應.同時,重組 TR基因酵母實驗和 GH3(TRβ-)細胞增殖實驗初步表明,TCPP可能通過基因組途徑和非基因組途徑實現(xiàn)其甲狀腺激素干擾.

3.2 TCPP對GH3細胞相關基因mRNA表達影響測試結果表明:TCPP與T3的共同暴露,下調c-fos、TRβ、integrin-av和k-ras的mRNA表達.初步認為TCPP可能通過影響 TRβ基因表達和激活 αvβ3-ERK-1/2信號通路產生甲狀腺激素干擾效應.

3.3 本研究初步表明 TCPP不僅可以通過基因組途徑,還可以通過非基因組途徑實現(xiàn)對甲狀腺激素的干擾.結果能夠更加全面地反映 TCPP的生物學毒性,有利于進一步開展 TCPP的生態(tài)和健康風險評價.

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