高松紅，單柏宇，徐 陽，鮑慧瑋

(1.長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林長春 130000；2.白城市食品藥品檢驗所，吉林白城 137000； 3.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春 130117)

[通訊作者]鮑慧瑋(1989- )，女，實驗師，碩士，從事中藥質(zhì)量控制及藥效學研究。

五加生化膠囊收載于《國家藥品標準-新藥轉(zhuǎn)正標準》第33冊，主要由刺五加浸膏、當歸、川芎、桃仁、干姜、甘草組成，其中刺五加和當歸為君，具有益氣復原、祛瘀生新和養(yǎng)血活血的作用；桃仁和川芎為臣，具有活血化瘀的作用；干姜為輔，具有止痛止血的作用。多味藥聯(lián)合起效，對于產(chǎn)后、經(jīng)期、人流后氣虛血瘀所至陰道流血的癥狀，具有良好的藥效作用[1]。

阿魏酸(圖1)是當歸和川芎中主要的有效成分之一。阿魏酸具有調(diào)節(jié)人體生理機能[2-7]，抗血小板聚集，增強前列腺素活性，鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣等作用[8]，是治療心腦血管疾病、白細胞減少等疾病藥品的基本原料[9-10]。槲皮素(圖2)主要來源于刺五加，具有祛痰、止咳、平喘；抗菌、抗炎；清除自由基、抗氧化、抗腫瘤，抑制血小板凝結(jié)、抗動脈粥樣硬化等作用[11-12]。槲皮素具有較強的抑制血小板活化因子(PAF)的作用[13-14]，能明顯地抑制凝血酶誘導的兔血小板3H-5-HT釋放[15]?，F(xiàn)五加生化膠囊質(zhì)量控制主要依據(jù)《國家藥品標準-新藥轉(zhuǎn)正標準》，對異嗪皮啶的含量進行測定，但單一成分的測定并不能準確反映五加生化膠囊的質(zhì)量，故本文選取當歸中主要藥效成分阿魏酸和刺五加中主要黃酮類成分槲皮素進行測定，給整體控制五加生化膠囊質(zhì)量提供參考。

圖1 阿魏酸

圖2 槲皮素

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC2030型高效液相色譜儀(日本島津有限公司)；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；AVW20D型電子天平(日本島津有限公司)；KQ-400KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

槲皮素對照品(批號：100081-201408，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇(色譜純，美國FISHER公司)，無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、磷酸(分析純，北京化工廠)，水(純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司)。五加生化膠囊(規(guī)格0.4g/粒，批號：1603011，多多藥業(yè)有限公司)。

1.2 混合對照品溶液的配制

精確稱量阿魏酸和槲皮素對照品適量于10 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，甲醇定容至刻度，超聲10 min，即配制成0.5 mg/mL的阿魏酸和槲皮素的對照品溶液，過0.22μm微孔濾膜，得混合對照品溶液。

1.3 供試品溶液的配制

取5 g五加化膠囊內(nèi)容物，置具塞錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，重復三次試驗，合并濾液。將濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，加適量甲醇超聲溶解，用5 mL容量瓶定容至刻度，過0.22μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗

色譜柱：Diamonsil C18(4.6×250 nm，5μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(46∶54，V/V)；柱溫：40 ℃；流速：1.5 mL/min；檢測波長：360 nm；進樣量：10μL。理論塔板數(shù)按阿魏酸和槲皮素計算均不低于2000，且阿魏酸、槲皮素與其它物質(zhì)分離度均大于1.5，符合《中國藥典》規(guī)定。實驗結(jié)果見圖3。

1.阿魏酸；2.槲皮素(A為空白色譜圖；B為對照品色譜圖；C為供試品色譜圖)圖3 HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

分別精密稱取阿魏酸、槲皮素對照品20.32 mg、3.67 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，即得2.032 mg/mL的阿魏酸和0.367 mg/mL的槲皮素混合線性對照品母液。分別精密吸取0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL的混合對照品母液置5 mL量瓶中，定容至刻度，即0.2032、0.4064、0.6096、0.8128、1.016 mg/mL的阿魏酸和0.0367、0.0734、0.1101、0.1468、0.1835 mg/mL的槲皮素線性對照品溶液。按照2.1中的條件，將母液與配制的對照品溶液分別注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(y)，對照品濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線。得到阿魏酸的回歸方程為y=26574x+10.83，r=0.9996(n=6)，在0.2032～2.032 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。槲皮素的回歸方程為y=5362x+18.3，r=0.9996(n=6)，在0.0367～0.367 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗

按照2.1中的條件分別精密吸取混合對照品溶液和五加花膠囊供試品溶液(批號：1603011)各10μL，連續(xù)進入高效液相色譜儀6次，測得槲皮素標準品、阿魏酸標準品和供試品中槲皮素、阿魏酸色譜峰面積的RSD值分別為0.83%、0.21%、1.48%和1.01%，結(jié)果表明此方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h時，按照2.1中的條件測定槲皮素標準品、阿魏酸標準品和五加生化膠囊供試品(批號：1603011)中槲皮素、阿魏酸的峰面積，計算RSD值，分別為0.11%、0.76%、1.87%和1.40%(n=8)，結(jié)果表明，混合對照品溶液和供試品溶液中阿魏酸、槲皮素具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 重復性實驗

取五加生化膠囊(批號：1603011)內(nèi)容物6份，每份約5 g，精密稱量，按1.3制備供試品溶液，依法進行含量測定，測得槲皮素和阿魏酸色譜峰面積，并計算出其含量的RSD值為1.87%和1.65%，結(jié)果表明此方法重復性良好。

2.6 加樣回收率實驗

取6份阿魏酸標準品，每份約5 mg，分別置于1 mL容器中，適量甲醇溶解，定容至刻度，即濃度約為5 mg/mL的阿魏酸標準品溶液。分別吸取0.5 mL 5 mg/mL的阿魏酸標準品溶液置于6份約2.5 g的五加生化膠囊(批號：1603011)內(nèi)容物中，常溫下甲醇揮干。按照1.3項供試品配制方法進行制備，進行含量測定和回收率計算。平均回收率為100.62%，RSD值為0.83%，結(jié)果見表2。取6份槲皮素標準品，每份約7.5 mg，分別置于2 mL容量中，適量甲醇溶解，定容至刻度，即濃度約為3.75 mg/mL的槲皮素標準品溶液。分別吸取0.1 mL 3.75 mg/mL的阿魏酸標準品溶液置于6份約2.5 g的五加生化膠囊(批號：1603011)內(nèi)容物中，常溫下甲醇揮干。按照1.3項供試品配制方法進行制備，進行含量測定和回收率計算。平均回收率為99.52%，RSD值為1.23%，結(jié)果見表3。綜上表明此方法回收率良好。

表2 阿魏酸加樣回收率測定結(jié)果

表3 槲皮素加樣回收率測定結(jié)果

2.7 樣品測定

取不同批號的五加生化膠囊樣品，按照1.3項制備供試品溶液，分別精密吸取1.2項混合對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀中，依法進行含量測定，記錄色譜峰面積，并按照外標法計算供試品中阿魏酸和槲皮素的含量，結(jié)果見表4。

表4 同批五加生化膠囊內(nèi)容物中槲皮素和阿魏酸的含量測定結(jié)果

3 討論

通過對比超聲提取法、熱回流提取法、浸漬法和索氏提取法對五加生化膠囊中阿魏酸和槲皮素的提取效果，最終確定熱回流提取法和超聲提取法具有較好的提取效果，但由于超聲提取法更為簡便，利于供試品的配制，最終確定超聲提取法為最佳的提取方法。通過對比不同極性試劑對五加生化膠囊中阿魏酸和槲皮素的提取效果，最終確定無水乙醇和甲醇為最佳的提取溶劑，由于無水乙醇的毒性較小，故選擇無水乙醇為提取溶劑。本實驗從提取時間、提取次數(shù)、料液比三個方面綜合考察提取方法，最終確定取4 g五加生化膠囊加無水乙醇50 mL，超聲處理30 min，提取3次為最佳的供試品制備方法。

通過對比不同流動相體系、不同流動相比例、不同色譜柱溫度和不同的流速，最終確定在甲醇-0.1%磷酸水溶液(46∶54，V/V)，柱溫40℃，流速1.5 mL/min時阿魏酸和槲皮素與其它色譜峰具有良好的分離效果，且時間長度適宜。在檢測波長選擇方面，對比不同的檢測波長，最終確定360 nm下，供試品中阿魏酸和槲皮素具有良好的吸收，且分離度良好。

五加生化膠囊具有良好的藥效，在治療多種疾病方面具有重要作用?，F(xiàn)其質(zhì)量控制方法主要依據(jù)《國家藥品標準-新藥轉(zhuǎn)正標準》，對其中異嗪皮啶的含量進行測定。對于中藥復方藥，以其中一種成分來評價其質(zhì)量的優(yōu)劣并不科學，其藥效作用主要是多組分聯(lián)合起效。阿魏酸為當歸中的主要藥效成分和藥典中的指標性成分，槲皮素為刺五加中的主要黃酮類成分，它們具有多種藥效作用，且與五加生化膠囊藥效相符，故本實驗選取它們?yōu)橹笜诵猿煞?。此方法完善了五加生化膠囊的質(zhì)量評價方法，為其質(zhì)量控制奠定研究基礎(chǔ)。

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