孟祥武，陳　娟，黃　淼，瞿昌華，鄭　龍

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 恩施　445000)

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，具有分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能[1]。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞屬于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是除少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星狀膠質(zhì)細(xì)胞外的第四種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[2]。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、修復(fù)、重建等都具有密切關(guān)系[3]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在脊椎動物的發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與胚胎神經(jīng)發(fā)生及血管形成過程[4]。有研究表明，VEGF能夠促進小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì)神經(jīng)元的增殖和遷移[5-6]。而VEGF對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖和遷移影響是否同其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一樣？本研究以少突膠質(zhì)前體細(xì)胞為研究對象，探討血管內(nèi)皮生長因子對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖和遷移的影響，以期為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新思路。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

12只出生24 h的SPF級C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體重8～10 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK(京)2015-0001]，飼養(yǎng)于湖北民院附屬民大醫(yī)院動物實驗中心[SYXK(鄂)2014-0035]，所有實驗流程均經(jīng)動物倫理委員會通過(倫理審查證號：2015-0065)。

1.2　主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、LiCl均購自于美國Sigma；VEGF購自于美國Peprotech；MMP-9單克隆抗體、MMP-2單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體、C-myc單克隆抗體、cyclin D1單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自于上海研卉生物科技有限公司；酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱購自于美國Thermo；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3　實驗方法

1.3.1少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分離及實驗分組

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分離方法參照參考文獻[7]，取出生24 h的SPF級C57BL/6J小鼠，腹腔麻醉以后，無菌狀態(tài)下取其腦皮質(zhì)，剪碎后，加入胰蛋白酶消化15 min，1000 r/min離心5 min，棄上清液。在沉淀中加含有20% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液混合后，過篩(70 μm細(xì)胞篩)，接種到多聚賴氨酸提前包被的細(xì)胞瓶中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔72 h更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)9 d后，將培養(yǎng)瓶放在振蕩器上震蕩1 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入10 mL新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在振蕩器上震蕩1 h，收集上清液接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1 h。過篩(20 μm細(xì)胞篩)，吸取細(xì)胞懸浮液，1000 r/min，離心10 min，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液混勻后，接種到細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，分離培養(yǎng)的細(xì)胞特異性表達NG2，鑒定為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。取少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，用100 ng/mL的VEGF作用于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞記為VEGF組，以加入0 ng/mL的VEGF處理后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞記為對照組。

1.3.2MTT檢測細(xì)胞增殖

取出少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，用100 ng/mL的VEGF作用于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞記為VEGF組，每孔中加入100 μL的VEGF。每組設(shè)置8個復(fù)孔，同時設(shè)置空白組和對照組，空白組不加細(xì)胞，對照組中不加VEGF，其它步驟同VEGF組。放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸除孔內(nèi)VEGF，每孔中加入50 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育反應(yīng)4 h。吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，在細(xì)胞中加入DMSO溶液150 μL，震蕩反應(yīng)10 min，待結(jié)晶物完全融化后，酶標(biāo)儀檢測每孔的OD值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)

1.3.3Boyden chamber小室檢測細(xì)胞遷移

取少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，在多聚賴氨酸提前包被好的Boyden chamber小室的上室加入5×104個細(xì)胞，在小室的下室加入0 ng/mL、100 ng/mL的VEGF培養(yǎng)液，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽小心擦掉沒有穿過膜的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。用甲醇固定穿膜的細(xì)胞20 min。用0.1%的結(jié)晶紫染色15 min后，加入PBS洗滌后，隨機選取6個視野對遷移的細(xì)胞計數(shù)，實驗重復(fù)三次。

1.3.4Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞與100 ng/mL的VEGF作用48 h后，在細(xì)胞中加裂解液，在冰上裂解20 min后，4℃，10 000 r/min離心15 min，吸取蛋白上清，BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白樣品濃度。蛋白樣品與loading buffer混合煮沸變性后，80 V電壓電泳30 min后，待溴酚藍(lán)到達濃縮膠和分離膠邊緣時，調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳。取出蛋白凝膠在300 mA，4℃轉(zhuǎn)膜90 min。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后(37℃封閉2 h)。加入一抗(500倍稀釋)，室溫下孵育2 h，PBST洗滌后，加二抗(1000倍稀釋)孵育過夜。滴加DAB顯色液，暗室中曝光，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達水平。

1.3.5激活Wnt/β-catenin信號通路對細(xì)胞增殖遷移影響

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞與含有終濃度為20 μmol/L的Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用48 h后，記為激活劑組，以加入0 μmol/L的Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用48 h后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞記為未處理組，檢測細(xì)胞增殖遷移情況，Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平。

1.4　統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　少突膠質(zhì)前體細(xì)胞形態(tài)

顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞呈圓形或者呈球形存在，多數(shù)聚集成塊狀，有典型的雙極或者三級突起。(圖1)

圖1　分離培養(yǎng)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(×200)Fig.1　Isolation and culture of the oligodendrocyte precursor cells

2.2　細(xì)胞增殖結(jié)果

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞與VEGF作用后，MTT檢測48 h的細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，VEGF組細(xì)胞存活率明顯高于對照組(P< 0.01)。(圖2)

注：與對照組比，**P< 0.01。圖2　VEGF對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖影響結(jié)果Note. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.2　Effect of VEGF on the proliferation of the oligodendrocyte precursor cells

2.3　細(xì)胞遷移結(jié)果

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞與VEGF作用后，Boyden chamber小室檢測48 h細(xì)胞遷移情況。結(jié)果顯示，VEGF組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯高于對照組(P< 0.01)。VEGF組細(xì)胞中遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯高于對照組(P< 0.01)。(圖3)

注：(A)遷移結(jié)果圖；(B)遷移細(xì)胞數(shù)目；(C)Western blot結(jié)果圖；(D)蛋白表達率；與對照組比，**P< 0.01。圖3　VEGF對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞遷移影響結(jié)果Note.(A)Migration results map.(B)The number of migrated cells.(C)Western blot results.(D)Protein expression rate. Compared with the control group，**P< 0.01.Fig.3　Effect of VEGF on the migration of oligodendrocyte precursor cells

2.4　VEGF對細(xì)胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結(jié)果

Western blot檢測了VEGF作用48 h后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平。結(jié)果顯示，VEGF組細(xì)胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平均明顯高于對照組(P< 0.01)。(圖4)

注：(A)Western blot結(jié)果圖；(B)蛋白表達率；與對照組比，**P< 0.01。圖4　VEGF對β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結(jié)果Note.(A)Western blot results.(B)protein expression rate. Compared with the control group，**P< 0.01.Fig.4　Effect of VEGF on the expression of β-catenin，C-myc and cyclin D1

2.5　激活Wnt/β-catenin信號通路對細(xì)胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結(jié)果

收集Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，Western blot檢測細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平。結(jié)果顯示，激活劑組細(xì)胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平明顯高于未處理組(P< 0.01)。(圖5)

注：(A)Western blot結(jié)果圖；(B)蛋白表達率；與未處理組比，**P< 0.01。圖5　激活Wnt/β-catenin信號通路對β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結(jié)果Note.(A)Western blot results.(B)Protein expression rate. Compared with the untreated group，**P< 0.01.Fig.5　Effect of activation of Wnt/β-catenin signaling pathway on the expression of β-catenin，C-myc，and cyclin D1

2.6　激活Wnt/β-catenin信號通路對細(xì)胞增殖遷移影響結(jié)果

MTT檢測Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞48 h的細(xì)胞存活情況，Boyden chamber小室檢測48 h細(xì)胞遷移情況。結(jié)果顯示，激活劑組細(xì)胞存活率和遷移細(xì)胞數(shù)目均明顯高于未處理組，差異有顯著性(P< 0.01)。激活劑組細(xì)胞中遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯高于未處理組，差異有顯著性(P< 0.01)。(圖6)

注：(A)細(xì)胞存活率；(B)遷移結(jié)果圖；(C)遷移細(xì)胞數(shù)；(D)Western blot結(jié)果圖；(E)蛋白表達率；與未處理組比，**P< 0.01。圖6　激活Wnt/β-catenin信號通路對細(xì)胞增殖遷移影響結(jié)果Note.(A)Cell survival rate.(B)Migration results map.(C)Number of migrated cells.(D)Western blot results.(E)Protein expression rate. Compared with the untreated group，**P< 0.01.Fig.6　Effect of activation of Wnt/β-catenin signaling pathway on the cell proliferation and migration

3　討論

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[8]。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞能夠促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)及重建。中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的生長和少突膠質(zhì)細(xì)胞密不可分，而髓鞘在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中發(fā)揮積極作用[9-10]。有研究表明，在脫髓鞘病灶四周有許多少突膠質(zhì)前體細(xì)胞存在，這些細(xì)胞是從室管膜的下區(qū)增殖遷移而來[11-12]。研究少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要組成部分。

VEGF相對分子量為34～45×103，編碼VEGF的基因約為14 kb，該基因含有7內(nèi)含子和8個外顯子[13]。VEGF能夠促進血管生長，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂。近年來有研究表明，VEGF能夠促進神經(jīng)元的延伸[14]。用VEGF作用于移植的腦皮層，組織中神經(jīng)元延伸及神經(jīng)元存活情況均明顯增加[15]。過表達小鼠體內(nèi)的VEGF，神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度增加[16]。VEGF能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)缺氧對神經(jīng)元的損害[17]。背根神經(jīng)移植實驗證明，VEGF還具有促進雪旺細(xì)胞的增殖[18]。這些研究結(jié)果都表明，VEGF對神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護作用。除此之外還發(fā)現(xiàn)，VEGF能夠促進脊髓損傷小鼠膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖和遷移，對星形膠質(zhì)細(xì)胞的分裂也具有促進作用[19]。本研究中，通過體外分離培養(yǎng)小鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，經(jīng)VEGF作用后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖和遷移能力均明顯增高。這提示，VEGF具有促進少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖和遷移的作用。

Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞的生長過程中發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路是一種高度保守的信號通路，在真核生物體內(nèi)廣泛存在。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信號通路中的效應(yīng)因子，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用[20]。C-myc和cyclin D1是Wnt/β-catenin信號通路中的靶基因[21]。Wnt/β-catenin信號通路激活時，β-catenin、C-myc、cyclin D1表達增多[22]。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有保護作用，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[23]。VEGF能夠通過調(diào)控NOTCH、PI3K、ERK信號通路對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖和遷移發(fā)揮促進作用[24]。與NOTCH、PI3K、ERK信號通路一樣參與細(xì)胞生長的Wnt/β-catenin信號通路是否也與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖和遷移有關(guān)。本研究中，Western blot檢測了與VEGF作用后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF作用后的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平表達上調(diào)。進一步用Wnt/β-catenin激活劑處理少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯升高。

綜上所述，VEGF能夠促進少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖和遷移，作用機制與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。這為進一步研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成奠定了基礎(chǔ)，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新思路。