魏　強(qiáng)，程　潔，胡玉敬，邊艷珠*，董長(zhǎng)征

(1.河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，石家莊　050051； 2.河北省人民醫(yī)院口腔科，石家莊　050051； 3.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，石家莊　050051)

癲癇是一種臨床上表現(xiàn)為反復(fù)性、刻板性、暫時(shí)性及發(fā)作性的腦部疾病。由于感覺、意識(shí)、精神、運(yùn)動(dòng)、行為等發(fā)生了功能性障礙，給患者帶來沉重的心理及生理負(fù)擔(dān)[1-3]。因此深入的研究癲癇的發(fā)病機(jī)制及新治療藥物的開發(fā)至關(guān)重要。甘草酸是從甘草中提取出來的一種活性三萜皂苷類物質(zhì)，具有保肝、降血脂、降血壓、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[4-5]。同時(shí)，相關(guān)研究顯示甘草酸也具有神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]，還發(fā)現(xiàn)甘草酸作為高遷移率族蛋白1抑制劑能夠減輕癲癇對(duì)大鼠血腦屏障完整性的破壞[8]，但對(duì)于甘草酸是否能夠抑制癲癇引起大鼠海馬神經(jīng)損傷尚未見報(bào)道，因此本研究將對(duì)此展開探討。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠45只，4周齡，體重(200±20)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2012-0002]；實(shí)驗(yàn)在河北省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(冀)2013-0056]。溫度21℃～25℃，自由飲食飲水，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2　主要試劑及儀器

BCA法蛋白定量試劑盒，細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，Nissl染色試劑盒，細(xì)胞膜電位檢測(cè)試劑盒，caspase 3，9活性檢測(cè)試劑盒，TUNEL試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；BX53熒光顯微鏡購(gòu)于美國(guó)Olympus公司；轉(zhuǎn)印電泳儀，GelDocEZ凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1癲癇模型的制備[9-10]

取33只大鼠腹腔注射127 mg/kg氯化鋰，24 h后腹腔注射1 mg/kg阿托品，30 min后腹腔注射30 mg/kg匹魯卡品，并觀察大鼠行為，同時(shí)根據(jù)國(guó)際通用癲癇發(fā)作Racine分級(jí)進(jìn)行判斷，達(dá)到 IV級(jí)以上的說明癲癇點(diǎn)燃模型成功。大鼠癲癇持續(xù)發(fā)作30 min后給予10 mg/kg地西泮，直至癲癇發(fā)作終止，從而對(duì)癲癇進(jìn)行控制。其中癲癇發(fā)作4級(jí)以上的大鼠有28只，3級(jí)以下的有3只，2只在造模過程中死亡。

1.3.2分組及給藥

將造模成功的28只大鼠隨機(jī)選取24只分為癲癇組及甘草酸組，另外選取12只不做任何處理的大鼠作為正常對(duì)照組，甘草酸組在造模成功后灌胃給予30 mg/kg甘草酸，癲癇組及正常對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。大鼠麻醉后斷頭取腦組織，并在4℃條件下鈍性分離大鼠雙側(cè)海馬組織，在液氮罐中保存待測(cè)。

1.3.3Nissl法檢測(cè)細(xì)胞損傷

海馬組織切片于二甲苯、100%、95%、80%、70%酒精中浸泡2 min后，PBS洗滌，1%甲苯胺藍(lán)染色40 min，后分色，二甲苯、梯度酒精透明，封片，最后于顯微鏡下觀察并對(duì)尼氏陽性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將海馬組織切片置于二甲苯、100%、95%、90%、80%、70%的酒精中各浸泡5 min，后蛋白酶K室溫消化1 h、PBS洗滌3次，按TUNEL反應(yīng)試劑盒步驟對(duì)切片進(jìn)行染色、終止反應(yīng)、封片等，最后于熒光顯微鏡下觀察洗滌凋亡數(shù)目。經(jīng)TUNEL染色上的陽性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色。

1.3.5比色法檢測(cè)caspase 3、9活性

將海馬組織勻漿后加入胰蛋白酶裂解，離心收集上清液，按caspase 3、9活性檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)海馬組織中caspase 3、9活性。

1.3.6Western blot檢測(cè)cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1蛋白表達(dá)將海馬組織勻漿后加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，離心收集上清液即是總蛋白，測(cè)定蛋白濃度并定量，變性。制作濃縮膠及分離膠，蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，一抗溶液(兔抗cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1多克隆抗體)孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1～2 h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

注：與正常對(duì)照組比較，**P< 0.01；與癲癇組比較，##P< 0.01。下同。圖1　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷及凋亡的影響(×200，n=6)Note. Compared with the normal control group,**P< 0.01. Compared with the epilepsy group,##P< 0.01.The same below.Fig.1　Effect of glycyrrhizic acid on hippocampal neuron injury and apoptosis in epileptic rats

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷及凋亡的影響

與正常對(duì)照組比較，癲癇組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目增加(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增加、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目減少(P< 0.01)。(圖1)

2.2　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元線粒體膜電位的影響

癲癇組海馬神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位較正常對(duì)照組降低(P< 0.01)；甘草酸組海馬神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位較癲癇組增加(P< 0.01)。(圖2)

圖2　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元線粒體膜電位的影響(n=6)Fig.2　Effect of glycyrrhizic acid on mitochondrial membrane potential in hippocampal neurons of epileptic rats

2.3　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬組織中Caspase 3、9活性的影響

癲癇組caspase 3、9活性較正常對(duì)照組提高(P< 0.01)；甘草酸組caspase 3活性較癲癇組降低(P< 0.01)。(表1)

表1　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬組織中

2.4　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬組織中cleaved-caspase 3、9蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，癲癇組cleaved-caspase 3、9表達(dá)量上調(diào)(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組cleaved-caspase 3、9表達(dá)量下調(diào)(P< 0.01)。(圖3)

圖3　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬組織中c leaved-caspase 3、9蛋白表達(dá)的影響(n=6)Fig.3　Effect of glycyrrhizic acid on the expression of cleaved caspase 3, 9 proteins in the hypocampal tissues of epileptic rats

2.5　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬組織中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，癲癇組Bax表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2表達(dá)量下調(diào)(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組Bax表達(dá)量下調(diào)，Bcl-2表達(dá)量上調(diào)(P< 0.01)。(圖4)

圖4　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬組織中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(n=6)Fig.4　Effect of glycyrrhizic acid on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in the hypocampal tissues of epileptic rats

2.6　甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬組織中CytC/Apaf-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，癲癇組海馬神經(jīng)元線粒體中CytC表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)，細(xì)胞質(zhì)中CytC、Apaf-1表達(dá)量上調(diào)(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組海馬神經(jīng)元線粒體中CytC表達(dá)量上調(diào)(P< 0.01)，細(xì)胞質(zhì)中CytC、Apaf-1表達(dá)量下調(diào)(P< 0.01)。(圖5)

3　討論

癲癇是由多種因素導(dǎo)致大腦神經(jīng)元過度放電從而引起的一種刻板性、反復(fù)性、發(fā)作性的中樞系統(tǒng)疾病，是僅次于腦血管病的第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，并且發(fā)病率逐年上升。有研究顯示氯化鋰-匹魯卡品所構(gòu)建的癲癇動(dòng)物模型與人類高度相似，具有類似的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、損傷、丟失，膠質(zhì)細(xì)胞的激活、增生等病理改變[9-10]，因此本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)使用33只SD大鼠腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品點(diǎn)燃制作癲癇模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作4級(jí)以上的大鼠有28只，3級(jí)以下的有3只，2只在造模過程中死亡，造模成功率為84.8%。同時(shí)Nissl法及TUNEL法顯示癲癇動(dòng)物海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，凋亡增加，從而說明大鼠癲癇模型構(gòu)建成功。

研究表明癲癇能夠造成動(dòng)物腦部神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)功能受損、學(xué)習(xí)及記憶等認(rèn)知功能減退[9-10]。因此，本研究首先通過Nissl及TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)甘草酸對(duì)癲癇大鼠海馬損傷及凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘草酸能夠顯著的增加癲癇大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量，減少海馬神經(jīng)元凋亡，與甘草酸減輕帕金森、阿爾茲海默病引起的大鼠腦神經(jīng)元凋亡結(jié)果類似[6-7]，說明甘草酸對(duì)癲癇引起的大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有一定的抑制作用。

線粒體為細(xì)胞代謝提供充足能量，而癲癇能夠引起神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致線粒體膜電位降低、細(xì)胞膜通透性增加，最終使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[11-13]。當(dāng)線粒體受到外界凋亡信號(hào)刺激后，促使線粒體中CytC釋放，CytC進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)形成復(fù)合物后，激活caspase 9，caspase 9通過級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，將凋亡信號(hào)傳遞給caspase 3，最終導(dǎo)致DNA斷裂，細(xì)胞凋亡[14]。另外細(xì)胞的凋亡又受凋亡蛋白調(diào)控，Bcl-2家族是其中一種，抑制凋亡蛋白Bcl-2與凋亡蛋白Bax形成復(fù)合物，阻斷凋亡信號(hào)傳遞，最后使細(xì)胞存活。研究顯示甘草酸對(duì)細(xì)胞線粒體途徑具有一定的調(diào)控作用[15]。因此本研究進(jìn)一步的探討了甘草酸對(duì)線粒體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明甘草酸能顯著提高線粒體膜電位，降低caspase 3、9活性，上調(diào)Bcl-2及線粒體中CytC表達(dá)，下調(diào)Bax、細(xì)胞質(zhì)中CytC及Apaf-1表達(dá)，最終抑制癲癇引起的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，為甘草酸在癲癇的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。